[发明专利]一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生殖生理与生物技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。

背景技术

目前核移植的效率平均不到10％。体细胞核移植效率的提高，有赖于各环节的进一步完善，而供体细胞的准备是核移植关键的一步。供体细胞的来源和种类，不同发育阶段的供体核，以及供体细胞体外培养的代数和供体细胞来自个体的年龄等的不同，其核移植效果都存在着很大差异。

当前一些研究是从细胞的代数上进行选择，研究结果尚无定论(高国龙，牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究；博士论文，2007)，但是在目前很多核移植研究中，大多数使用的是传代次数较少的细胞，一般为4-6代，很多学者认为这类细胞利于核移植胚的发育。在注入受体细胞前，供体细胞的体外传代培养，极有可能造成遗传损伤。所以，研究者们一般采用短期培养的细胞(10代以内)做核供体，不过也有例外，Kubota等用成年牛体细胞传至10和15代的细胞进行克隆的重构胚发育率比传5代的高，并且只有传至10和15代的细胞进行克隆得到了克隆牛犊。这个明显不同的研究结果可能是与供体动物年龄和供体细胞体外培养的时间长短有很大关系，也可能是由于不同细胞系在分化过程中上产生竞争的差异引起的。但理论倾向于原代细胞(十代以内)作为核供体较好。

还有些研究是从细胞的来源上进行选择，如牛的卵丘细胞，输卵管上皮细胞跟成纤维细胞比较前两者克隆囊胚率较高(Kato Y，et al.Eight calves cloned from somatic cells of a single adult.Science，1998，282：2095.Kato Y，et al.Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult，new born and fetal cows.J Reprod Fertil，2000，120：231)，但是材料的获得会涉及动物的屠宰或对动物体伤害较大的手术，在科技日益发达和动物福利日益提高的今天，我们并不提倡用前两种材料。用牛耳组织成纤维细胞，不但对牛的伤害较小，改善细胞培养技术后还可相应的提高克隆形成率，是值得推广的技术。

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)又被称为三原子氧，是在自然界普遍存在的，它是氧的代谢产物和一些氧化还原反应产生的含氧物质的总称(Kalghatgi，Fridman et al，2009)。生物体内的ROS可通过机体酶系统和非酶系统产生的内源性活性氧，也可来自环境的外源性活性氧。体内ROS可在很多反应过程中产生(Miranda，Purdie et al.)。

在有机体组织的正常氧化代谢过程中产生的ROS，通常通过组织内部的防御机制来维持平衡。但是在一些损伤因素的作用下，细胞中抗氧化保护机制不足时，细胞内的氧化代谢物增加，使ROS产生堆积并对细胞产生毒性。在体外培养的情况下，我们可以人为的加入一定量的抗氧化剂(Antioxidants)，使细胞免于氧化应激和一些可控制的氧化损伤，使细胞保持更强的活力，更好的传代培养，以供我们的后续研究。

目前研究中所用的抗氧化剂主要分为两类：酶类抗氧化剂主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、亚牛磺酸等和非酶类抗氧化剂主要包括维生素C(VC)、维生素E(VE)、β-巯基乙醇(2-巯基乙醇，β-mercaptoethanol，β-ME)，氮-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、褪黑素(Melatonin，MLT)、类胡萝卜素(Carotenoid)、α-硫辛酸(α-Lipoic acid)、微量元素铜、锌、硒(Se)等(Sakamoto，Munemura et al，2008)。

有研究证实，在体外培养动物体细胞时，在培养过程中添加抗氧化剂能够提高细胞的抗氧化能力。Zhou等考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。试验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧化剂有利于延长细胞的寿命，其中效果最好的是巯基乙醇，其次为CAT和SOD，试验还发现，添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率，减缓细胞衰老速率，利于细胞的生长(Zhou T et al，2002)。而将β-巯基乙醇用于牛供体细胞的培养现在还未发现。

发明内容