[发明专利]番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法

权利要求书

1.番茄溃疡病菌分子标准样品，其特征在于：以分离的番茄溃疡病菌菌株为原料提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到番茄溃疡病菌的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量5±0.0016μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.7～2 ；（4）易溶于水，或TE（Tris-EDTA）缓冲液中。

2.根据权利要求1所述的番茄溃疡病菌分子标准样品，其特征在于：DNA纯度：OD260/280=1.8。

3.番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是：包括如下步骤：

（1）番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26℃培养24h；

（2）提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA；

（3）DNA 质量及完整性检测、DNA浓度及纯度检测；

（4）标准样品的制备：将测定浓度后的DNA按5μg/管进行分装，然后冻干，即为目的标准品。

4.根据权利要求3所述的番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是：制备的标准样品定性鉴定：取制备的标准样品，加入50μlTE，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

正向引物（F）：5'-tcattggtcaattctgtctccc-3'

反向引物（R）：5'-tactgagatgtttcacttcccc-3' 

PCR扩增 PCR扩增采用25 μL体系，如下：

2X PCR MasterMix12.5 μLPrimers(5 μM)2 μLTemplate1 μLddH2O9.5 μLTotal25 μL

PCR反应参数：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，62.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min；

按上述条件将该病菌进行特异性引物的PCR扩增，扩增后，可产生片断250bp左右的片断，表明该病菌即为番茄溃疡病菌。

5.根据权利要求3所述的番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是：所述提取番茄溃疡病菌DNA，具体步骤是：

（1）番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26℃培养24h；

（2）提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA：

① 取新鲜培养的相应致病菌增菌液1mL于2mL离心管中；

② 以13000r/min离心3min，吸弃上清；

③ 加入100μL DNA提取液；

④ 震荡混匀后（没有细菌菌块）沸水浴10min，13000r/min离心3min；

⑤ 取上清液到1.5mL离心管中保存于-20℃备用。