[发明专利]番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及番茄溃疡病菌分子标准样品，另外本发明还涉及其制备方法，属于植物检疫技术研究领域。

背景技术

国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多，而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步，很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心（ATCC）的菌株作为阳性对照，其价格非常昂贵，国内几乎无法购买到，而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道，所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子DNA标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供番茄溃疡病菌分子标准样品，均匀性和稳定性佳，另外本发明还提供其制备方法，工艺简单，易于操作。

本发明番茄溃疡病菌分子标准样品，

番茄溃疡病菌分子标准样品的制备方法，具体步骤是：

（1）番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26℃培养24h；

（2）提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA：

① 取新鲜培养的相应致病菌增菌液1mL于2mL离心管中；

② 以13000r/min离心3min，吸弃上清；

③ 加入100μL DNA提取液；

④ 震荡混匀后（没有细菌菌块）沸水浴10min，13000r/min离心3min；

⑤ 取上清液到1.5mL离心管中保存于-20℃备用。

   （3）标准样品的制备

将测定浓度后的DNA按5μg/管进行分装，每种核酸分子标样分装150管，然后冻干，即为目的标准品。

    本发明制得的标准样品进行定性分析实验，具体是取制备的核酸标准样品，加入50μlTE，溶解后作为模板使用，经采用特异性进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品。例：

正向引物：5'-tcattggtcaattctgtctccc-3'

反向引物：5'-tactgagatgtttcacttcccc-3'

PCR扩增 PCR扩增采用25 μL体系，如下：

2X PCR MasterMix12.5 μLPrimers(5 μM)2 μLTemplate1 μLddH2O9.5 μLTotal25 μL

PCR反应参数：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，62.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增后，可产生片断250bp左右的片断。

本发明番茄溃疡病菌分子标准样品可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到10^-4倍。该标准品可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。

本发明标准样品制备工艺步骤简单，易于操作，制得样品均匀性和稳定性良好，有铲促进实验室检疫鉴定工作，提高实验室检测水平。

四、附图说明

图1是番茄溃疡病菌总DNA电泳图。

图2是番茄溃疡病菌特异性引物PCR产物电泳结果图，图中1为番茄溃疡病菌DNA扩增后产物，2为健康番茄DNA，3号为空白对照。

五、具体实施方式