[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用

权利要求书

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于：包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种编码权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于：包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种编码权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种含有权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶基因的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为不含抗菌素基因的载体。

7.根据权利要求5或6所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为重组质粒pGAPHa/β-glucosidase。

8.一种含有权利要求5-7任一所述的表达载体的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为生产β-葡萄糖苷酶的毕氏酵母工程菌。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No.4891。

10.一种构建权利要求8或9所述的重组菌的方法，其特征在于：将权利要求5-7任一所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达。

11.根据权利要求10所述的构建重组菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒β-glucosidase/pCR2.1，所述的重组质粒β-glucosidase/pCR2.1是目的基因pyrococcus furiosus CelB插入到质粒pCR2.1中形成的重组质粒； 

(2)以重组质粒β-glucosidase/pCR2.1为模板，设计如下突变引物：

371-F：5′-ctaccaatgataattgcagagaacggtatggccgatgcagca-3′；

371-R：5′-ggccataccgttctctgcaattatcattggtagctcgatgg-3′；

经过PCR反应将目的基因的第1111-1113位的TAC突变为GCA，使得目的基因突变后第371位编码为亮氨酸，制备出重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase；

(3) 将重组突变质粒pGAPHa/β-glucosidase转入大肠杆菌Top10中进行扩增后用AvrII/BglII酶切，除去抗氨苄西林抗性基因，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，用组氨酸缺陷培养基和X-gal染色双重筛选出阳性菌落，即构建成表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌；

(4) 将步骤(4)构建的重组菌株，再经过β-半乳糖苷酶和乳糖水解筛选，选出高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母工程菌。

12.根据权利要求8或9所述的重组菌产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：在适于毕赤酵母菌株生长的培养条件下培养本发明所述的重组菌。

13.根据权利要求12所述的重组菌产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：将所述重组菌接入含有碳源、氮源的发酵培养基中，调节溶氧量DO≥20%，控制pH4.8-5.2、温度28℃-30℃，发酵培养4-5天。

14.一种β-葡萄糖苷酶，其是由保藏编号为 CGMCC No.4891的菌株所编码的。

15.根据权利要求1或2或14所述的β-葡萄糖苷酶在转化乳糖方面的应用。

16.根据权利要求8或9所述的含有β-葡萄糖苷酶的重组菌在转化乳糖方面的应用。