[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够分解乳糖的在高温和低温条件下都具备很强活性的β-葡萄糖苷酶，并能够高效表达的分泌型β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)系统名称为β-D-葡萄糖苷水解酶，属于水解酶类。它可以催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基和葡萄糖体。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，多年来许多学者分别从苦杏仁、葡萄、刀豆、玉米、黑樱桃、水稻、大豆中分离纯化得到了β-葡萄糖苷酶。在哺乳动物的小肠粘膜上皮细胞也存在β-葡萄糖苷酶，如果该酶缺乏，将引起相应碳水化合物的吸收受到限制。β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界的植物、动物以及微生物中，但酶活普遍较低，且不易纯化；而通过液态发酵得到的β-葡萄糖苷酶活性也普遍较低；固态发酵生产的β-葡萄糖苷酶则成分复杂，不易提取。因此运用基因工程手段构建高效表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌成为当今研究β-葡萄糖苷酶的热点，并具有重要的现实意义。

β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在几十kDa至几百kDa之间。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。迄今为止，β-葡萄糖苷酶主要是从曲霉菌以及部分嗜热细菌中分离得到的，从嗜热细菌中分离出β-葡萄糖苷酶具有很强的热稳定性。对于工业应用来说，酶的热稳定性越高越有利，因此从嗜热细菌中分离得到的β-葡萄糖苷酶逐渐引了人们的兴趣。美国专利US6355467B1公开了一种Pyrococcus furiosus菌种中含有的β-葡萄糖苷酶，其可以将纤维素分解得到葡萄糖，并且其耐热温度高达95℃。中国专利CN1245507C公开了一种耐高温β-葡萄糖苷酶，并通过基因工程的手段构建出一种可耐高温的新型β-葡萄糖苷酶。

β-葡萄糖苷酶它主要作用于β-(1,4)糖苷键，β-葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用，同时微生物生产的β-葡萄糖苷酶种类众多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多方面不同的性质，从而导致各具特色的应用范围。对于β-葡萄糖苷酶的水解作用人们早已认识，比如应用到葡萄酒、茶叶中增加香味，将纤维素降解等等。中国专利CN101619336 “一种生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法”就是利用β-葡萄糖苷酶的水解作用来生产毛蕊花糖苷。β-葡萄糖苷酶有7个家族组成，第1家族的高温β-葡萄糖苷酶不但具有葡萄糖苷酶活性，而且还具有很强的半乳糖苷酶的作用（Km=2.3mm,Kcat(s^-1)=2050±86），所以耐高温β-葡萄糖苷酶也称为乳糖酶，可应用于乳品工业来分解乳糖，将乳糖分解为低聚半乳糖和葡萄糖。β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，乳糖是肌体组织和细胞能量的主要来源，尤其是乳糖的分解产物-低聚半乳糖，改善脂质代谢，降低血清胆固醇，促进钙吸收，促进B族维生素合成，对胎儿、婴幼儿非常重要。

目前乳品及食品工业用乳糖酶主要从酵母和曲霉中得到，帝斯曼公司使用kluyveromyces lactis产生的乳糖酶的最适pH为6.6-6.8，与新鲜牛乳的天然pH相近，该酶的分子量为116KD，在35℃、pH6.2-7.0时，该酶的活性较稳定，但超出此范围其酶活迅速下降。较高浓度的Ca²⁺对酶有抑制作用，酶的水解产物半乳糖和葡萄糖均对该酶的活性有强烈的抑制作用。

现在商业用酶均为胞内酶，然而不仅产率低并且分离及纯化程序比较复杂，使得现今商业用酶的市场价格比较昂贵。同时纯度较低的酶在使用时增加许多无用的酵母蛋白，影响牛奶的质量。

在高温条件下，乳糖很容易水解。高温时酶的活性很高，在牛奶巴氏消毒或高温消毒时进行乳糖水解会得到好的结果。由于巴氏消毒或高温消毒时间较短，制备牛奶的工艺很长时间主要在低温条件下进行，为了使乳糖彻底水解，要求高温乳糖酶在低温区仍有很高的活性，以达到完全水解乳糖的目的。从食品安全性考虑，在乳业生产上加入低温酶容易引起污染，而高温酶在100℃几十个小时不会影响活性，所以乳糖酶可以被“消毒”处理，添加乳糖酶不会导致乳制品的污染。

麦芽汁培养基是做为啤酒生产的培养基，安全性可达100%，所以高温β-葡萄糖苷酶以麦芽汁作为培养基。

因此，目前来说研发一种新型乳糖酶兼具高温、低温酶活性，和建立安全、有效、经济的工业化生产工艺是研究的重点和难点。

发明内容