[发明专利]一种利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的方法

说明书

技术领域

本发明属于冷等离子体技术在生物学领域的应用，特别涉及利用大气压冷等离子体提高细胞膜通透性的应用。

背景技术

等离子体是物质的第四态，放电过程可以产生大量高能电子、离子、分子、中性原子、激发态原子、光子和自由基，具有高度的物理和化学活性。大气压冷等离子体可以在大气压下通过气体放电获得，整个体系温度接近室温，具有作用效果显著、低能耗、无毒性等优点，因而在生物领域具有广泛的应用前景。

细胞膜是包围细胞质的一层半透性薄膜，其主要性状之一是选择通透性。细胞膜通透性的提高有利于细胞与周围环境之间的物质交换、能量转换和信号转导。

通常提高细胞膜通透性的方法包括物理方法(如电处理、超声波、渗透压等)和化学方法(如添加吐温、C16-18饱和脂肪酸、青霉素等)。但是，这些方法往往存在作用效果不明显、成本高、后处理不便等问题。本发明采用大气压冷等离子体这种条件温和且能量密度较高的方法对微生物细胞膜进行处理，可以高效、方便的提高细胞膜的通透性。

发明内容

本发明通过采用大气压冷等离子体中的介质阻挡放电等离子体作用于微生物细胞悬浮液，利用了大气压冷等离子体具有的条件温和且能量密度高的特点，达到了提高细胞膜通透性的目的，其具体操作步骤如下：

将微生物细胞悬浮液载于石英载片上，将载片置于大气压冷等离子体发生器的放电区，放电区金属电极的间距为1～12mm，外加电压0.5～100kV，频率0～50MHz，作用时间为10s～25min，作用温度为15～45℃；其中，放电区的工作气体为下述一种或几种的混合物：空气、氮气、氩气、氦气。

当上述操作条件为下述值时，处理的效果较佳：

当电极间距为3～4mm，外加电压为12kV，频率设定为20MHz，作用时间为30s～240s，作用温度为25℃，工作气体为空气时，提高细胞膜通透性的效果较佳。

当上述电极为下述的一种：铜、铝、不锈钢，尤其是不锈钢的时候，效果较佳。

当上述电极是平板型或同轴型，尤其是平板型的时候，效果较佳。

当上述微生物为原核微生物或真核微生物时，细胞悬浮液中的细胞个数为1×10⁵～1×10⁹个/mL，效果均较佳。

当上述原核微生物为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，细胞悬浮液中的细胞个数为1×10⁷个/mL时，效果较佳。

当上述真核微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，细胞悬浮液中的细胞个数为5×10⁵个/mL，效果较佳。

当上述细胞悬浮液按下述方法制备时，效果较佳：在无菌条件下，将培养至对数期的菌液收集、8000～10000r/min，0～4℃，离心20～30min后所得沉淀用0.05mol/L的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再用磷酸钾缓冲液稀释制得，其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.0。

本发明中涉及到的微生物细胞培养及微生物细胞悬浮液的制备方法，均属于本领域普通技术人员根据现有技术和常规实验能够完成的，因此在实现获得培养至对数期微生物并稀释至上述浓度范围的前提下，可通过调节培养基的种类、微生物接种的量、培养温度、或改变其他培养条件来实现。

有益效果：本发明具有操作简单、无毒性、高效性的特点。不会引发微生物细胞完全失活，并可以达到提高微生物细胞膜通透性的效果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。

以下结合大气压介质阻挡放电等离子体处理原核微生物克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)以及真核微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

Luria-Bertani(LB)培养基：

胰蛋白胨：10g；酵母粉：5g；氯化钠：10g；加水调至1L并调pH至7.0后，121℃灭菌后冷却备用。LB固体培养基在液体培养基基础上添加15g/L琼脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Peptone Dextrose，YPD)培养基：