[发明专利]甲1/甲3型流感病毒核酸双重荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

    本发明涉及一种同时检测甲型中甲1和甲3型流感病毒核酸双重荧光定量PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

流感是一种季节性疾病，在温带地区，流感会在整个冬季流行，在热带地区，流感病毒一年四季均存在，雨季流行多见。常见的甲型流感，俗称伤风，是由病原体为甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要传播方式是空气飞沫传播。流感发病严重程度与个体免疫状况有关。一般来说，仅约50%的感染病人会发展成典型流感临床症状。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛、全身症状轻、同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、眼痛、畏光等症状。发热体温可达39～40℃，一般持续2～3天后渐退。甲型和乙型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。

流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正黏液病毒科，其病毒基因组由8条负链RNA节段构成（如图1）。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同，分为甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒根据表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，分为16个HA亚型和9个NA亚型；乙型和丙型流感病毒不分亚型。甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的；乙型和丙型流感仅在人之间转播，以局部暴发和散发流行为特征。

引起流感大流行的主要是甲型流感病毒。流感病毒的检测方法主要有病毒的分离培养，免疫学诊断和分子生物学诊断。病毒的分离培养和免疫学诊断是流感的实验室诊断的常规方法，分子生物学诊断中出现了许多快速特异的方法,三种方法具有以下特点：

1）病毒分离培养对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，且各实验室分离阳性率各不相同，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要，目前仅用于实验研究。

2）血清学方法不能高通量处理样本，不能准确反映当前是否感染或携带病毒。血清学的诊断还存在滞后性，该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。

3）病毒核酸检测：由于以上两种方法费时、费力，为了提高检测速度，可直接从临床标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰）中检测病毒的核酸。该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对流感病毒感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量RT-PCR检测平台已成为最简捷和可靠的流感病毒检测方法。

从上面可见，常用的病毒分离法比较费时，血清学诊断方法存在滞后性，基因序列测定方法也较为复杂和繁琐的。因此，建立对甲1型和甲3型流感病毒的快速检测的技术，对建立规范的诊疗体系、识别重症及危重症患者和进行流感疾病早期预警都具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种甲1/甲3型流感病毒核酸双重荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的甲1/甲3型流感病毒核酸双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲1/甲3型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，

其中，

所说的RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水；

所说的RT-PCR反应液包括10×缓冲液、MgCl2和dNTPs；

所说的甲1/甲3型流感病毒双重反应液包括以下组分：

组分（1）：由一对检测甲1型流感病毒的引物和一条检测甲1型流感病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

    组分（2）：由一对检测甲3型流感病毒的引物和一条检测甲3型流感病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

所说的酶混合液：包括Taq酶和逆转录酶。

表1为上述甲1/甲3型流感病毒引物和探针的序列。

优选地，