[发明专利]基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法

权利要求书

1.脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，其特征在于，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

2.一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据权利要求1所述的脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针设计待测肉类的特异性引物和探针，该待测肉类的特异性引物和探针序列是提供该待测肉类来源的动物的保守序列，且该待测肉类的特异性引物和探针与权利要求1所述的引物和探针的Tm值、扩增片段长度和扩增效率相似度为97％以上；所述探针的5’端连有荧光报告基团，3’端连有荧光淬灭基团；

2)以该待测肉类的纯肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用步骤1)设计的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(样品浓度)为横坐标，以(C_{t纯肉样品}-C_t通用)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₁、截距为C₁；

3)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测肉类}和C_t通用′，通过下式计算得到该混合肉制品中待测肉类的成分百分含量：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

4.权利要求2或3所述的方法在测定混合肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼肉成分含量中的应用。

5.猪特异性寡核苷酸引物和探针，其特征在于，

上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’；或

5’-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’；

探针为：5’-F-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

6.根据权利要求5所述的引物和探针，其特征在于，

所述上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

所述下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

所述探针为：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

7.一种基于RT-PCR测定混合肉制品中猪肉成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用权利要求6所述的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(纯猪肉样品浓度)为横坐标，以(C_t纯猪肉-C_t通用″)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₂、截距为C₂；

2)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用权利要求8所述的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测猪肉}和C_t通用′″，通过下式计算得到该混合肉制品中猪肉的成分百分含量：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

9.含有权利要求1所述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及权利要求6所述猪特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒。

10.权利要求9所述的试剂盒在测定混合肉制品中猪肉成分含量中的应用。