[发明专利]基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检验和生物技术领域，具体地说，涉及一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法。

背景技术

食品″掺杂使假″一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法企业和商家为了降低成本，在肉制品加工过程中以猪肉冒充牛羊肉，或以其它低价肉替代高价肉而未在标签上注明。这不仅严重侵害了消费者利益，而且如果清真食品中掺有猪肉成分还会涉及到民族和宗教等问题，造成恶劣的社会影响。此外，流行病学研究证明饲料中的动物源性成分是造成“疯牛病”等神经系统疾病传播的主要因素。

目前，用于肉种成分鉴定的技术大都建立在对蛋白质结构与DNA序列特异性分析的基本上，包括酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、电泳、色谱、生物传感分析等技术。其中Taqman实时荧光PCR(Taqman RT-PCR)法在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的主流技术，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。

然而，现有的研究大多集中在对饲料中猪、牛、羊等动物源性成分的定性检测上，而用于食品掺假鉴别，特别是涉及有关核酸成分定量检测技术的研究较为滞后。单纯的定性检测已不能满足需求，如在肉、奶等食品“掺杂使假”案件的处理中，如何判定掺假成分是添加还是污染所致，如何确定掺假严重程度都需要有可靠的定量技术作为依托。生物样品的复杂性，如动物种别、年龄、性别、器官、肌肉类型差别等，导致DNA提取总量和扩增靶序列模板总量差异，给标准样品的选定和制备造成困难。因此急需系统误差小、可信度高的食品掺假行为性质判定技术的出现。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测混合肉制品中猪肉成分含量的实时荧光PCR猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类，特别是猪肉成分含量的方法。

本发明的进一步目的是提供含有脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及猪特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，其是根据脊椎动物线粒体DNA(16s rDNA)上的保守序列设计的，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

本发明还提供一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法，包括以下步骤：

1)根据上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针设计待测肉类的特异性引物和探针，该待测肉类的特异性引物和探针序列是提供该待测肉类来源的动物的保守序列，且该待测肉类的特异性引物和探针与权利要求1所述的引物和探针的Tm值、扩增片段长度和扩增效率相似度为97％以上；所述探针的5’端连有荧光报告基团，3’端连有荧光淬灭基团；

2)以该待测肉类的纯肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用步骤1)设计的引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(样品浓度)为横坐标，以(C_{t纯肉样品}-C_t通用)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₁、截距为C₁；

3)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测肉类}和C_t通用′，通过下式计算得到该混合肉制品中待测肉类的成分百分含量：

前述的方法，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

本发明还提供上述方法在测定混合肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼肉成分含量中的应用。

本发明还提供一种猪特异性寡核苷酸引物和探针，其是根据不同动物物种之间线粒体ND4基因上的DNA序列多态性设计的，

上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’；或