[发明专利]一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法

权利要求书

1.一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌，混匀后滴加至标准铝皿中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph

将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量

在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度T_ph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线；

(3)细胞体积的换算

将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定从起始温度冷冻至任意终结温度T时的放热量Δq(T)_dsc及全过程中的放热量Δq_dsc，再结合细胞初始体积V₀及非渗透性体积V_b，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；

V(T)=V0-Δq(T)dscΔqdsc(V0-Vb)---(1)]]>

三.确定红细胞的渗透参数：L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

Lp=Lpg[cpa]×exp[-ELp[cpa]R(1T-1TR)]---(3)]]>

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

Wt=Vt-VbV0-Vt---(4)]]>

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。

2.一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液弃去血浆及白膜，而后反复洗涤，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备细胞悬液，随后添加丁香假单胞菌，混匀后滴加至容器中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量；

(3)细胞体积的换算；

三.确定红细胞的渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]

将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；

Lp=Lpg[cpa]×exp[-ELp[cpa]R(1T-1TR)]---(3)]]>

式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；

四.确定最佳降温速度理论值

将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；

随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；

Wt=Vt-VbV0-Vt---(4)]]>

式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。