[发明专利]一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种最佳降温速度的预测方法，尤其涉及一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法。

背景技术

目前血液中心或血库普遍采用4℃液态保存，但是在保存期内，细胞的ATP及2，3-DPG含量会逐步下降，直接影响治疗效果，而且保存期短(仅42天)。冷冻红细胞则以质量可靠，解冻洗涤后细胞形态及生化特性与4℃液态保存的红细胞相似，且保存期长达10年，成为稀有血型及自体输血的主要保存方式，此外还能应对战事、自然灾害等突发事件的血源需求。

为了减少生物材料遭受低温损伤，确定冷冻时最佳降温速度是亟待解决的问题，通常该速度应能足够慢以规避胞内冰形成，同时又足够快以避免细胞严重脱水。研究人员往往通过不同降温速度实验，借助若干生化指标筛选出效果最佳的实验方案，整个流程繁琐而冗长。因此，事先获知低温下细胞膜水分跨膜转运量及转运速度，这对准确估计最佳降温速度范围提供极大的便利，大幅降低原有工作量，为红细胞低温保存规程提供操作参考值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，可以形象刻画细胞在低温环境中的应激反应，掌握细胞遭受低温损伤的发展进程，又能根据细胞失水状况确定细胞在特定保存液中的最佳降温速度，提高红细胞低温保存效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

一、制备试样

将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；

将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌，混匀后滴加至标准铝皿中，称重密封；

二、DSC试验温度程序

(1)测定保存液的熔融温度T_ph

将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度T_ph；

(2)测定细胞悬液的放热量

在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度T_ph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线；

(3)细胞体积的换算

将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定Δq(T)_dsc及Δq_dsc，再结合细胞初始体积V₀及非渗透性体积V_b，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；

V(T)=V0-Δq(T)dscΔqdsc(V0-Vb)---(1)]]>