[发明专利]一种植物转化载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种植物转化载体，名称为pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP，其特征在于：所述载体用红色荧光蛋白UPMT和抗性筛选alad基因作为转染植物的报告基因及选择标记，红色荧光蛋白UPMT为能用于微生物、植物和动物稳定表达的尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA；抗性筛选alad基因为5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad。

2.根据权利要求1所述的植物转化载体，其特征在于：所述植物转化载体的主要构件是复制起始原点－卡那霉素抗性基因－泛素启动子Ubi promoter-5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad－CaMV 35S启动子－尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。

3.根据权利要求1所述的植物转化载体，其特征在于：该植物转化载体适用于农杆菌介导的植物转基因，包括原核复制起点ori、5'-3'依次含有pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因及农杆菌转染时能够进入植物细胞的T-DNA区域；MCS多克隆位点下游泛素启动子Ubi promoter，该启动子下游含有5-氨基酮戊酸脱水酶的编码基因alad；含有CaMV 35S组成型表达启动子，该启动子下游有尿卟啉原III甲基化酶的编码基因cobA。

4.根据权利要求1所述的植物转化载体，其特征在于：所述植物转化载体的基础构架载体为pCAMBIA1301。

5.一种构建权利1所述的植物转化载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，

1）报告基因cobA和抗性筛选标记alad基因的克隆；

2）将原始载体pCAMBIA1301载体经Nco I和BstE II酶切去除β-葡糖糖苷酸酶基因的线性化载体，与经Nco I和BstE II限制性酶消化所得编码尿卟啉原III甲基化酶UPMT的cobA基因片段按照分子生物学手段连接连接获得pC1301pUP载体；

3）将pC1301pUP载体经Xho I消化及去磷酸化与bar基因片段连接获得载体pC1301BpUP载体； 

4）原始载体pCAMBIA1301载体用限制性酶Xho I消化及去磷酸化反应后，回收纯化并自连接，获得无潮霉素抗性选择标记的载体pC131；

5) 将N端带有泛素启动子Ubi promoter、终止子Nos及含叶绿体导肽的alad基因片段插入经限制性酶EcoR I和Hind III消化的p131载体，获得载体pC1301Ubi-ZmpBtAD；

6）pC1301Ubi-ZmpBtAD载体经Nco I和BstE II酶切消化后，与经同样酶切的含cobA基因的片段连接构成pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体；

    或者pC1301-pUP载体经EcoR I和Hind III酶切消化后，与经同样酶切的含alad基因的片段连接构成双选择标记pC1301Ubi-ZmpBtAD-pUP载体。

6.一种权利要求1~4中任意一项所述的植物转化载体在植物转化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为转基因水稻或烟草。