[发明专利]一种植物转化载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子生物学及细胞生物学领域，尤其涉及一种可用于植物(亚)细胞定位的靶基因特异性表达，具有红色荧光蛋白示踪及新型安全的抗性筛选标记的植物转化载体及其构建方法和应用。

背景技术

目前，用于转染及转化植物研究和谷类作物生长发育的大约55个标记基因已经被证实其有效性，安全性及科学研究和商业化应用。广泛应用于转基因植物中的标记基因分为两种：一种筛选标记；另一种方法是利用标记基因消除体系在细胞内剔除筛选标记，但是这种技术较为复杂，需要构建新的转基因载体，转基因作物繁殖2-3代才能剔除筛选标记。虽然人们设计利用了许多功能各异的标记基因，用于植物转化研究并取得了巨大进步，但也发现了这些标记基因的缺点与不足。人们担心抗生素基因在肠道转染细菌，影响抗生素治疗的有效性，给人类健康带来潜在风险。一些国家如德国已禁止种植含有抗生素基因的转基因农作物。同时有些专家认为(抗除草剂基因)可能逃逸到杂草中，造成生态灾难。此外，它们会影响转化细胞再生和多次转化。目前的解决办法有：对筛选标记风险评估，这个过程既昂贵又繁琐，且评估的安全结果不被公众所接受，迫切需要研究开发新的更加高效的标记基因或筛选体系。

标记基因依据筛选方法不同分为：选择标记基因(selectable marker gene)和报告基因(reporter gene)。前者通常指抗生素和除草剂抗性基因，后者报告基因指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。

传统绿色荧光蛋白GFP在显微镜观察下易淬灭，导致信噪比大，信号定位不清晰，本身激发光及发射光波长长，产热大，易造成所观察的细胞及组织的损伤。

选择标记基因依据非转化细胞在选择培养基上的生长状况分为两类：正向和负向选择标记基因。前者定义为不仅具有选择作用且可以促进转染组织的生长，而后者会导致被转染组织的死亡。抗生素抗性基因、抗除草剂抗性基因和能接触化合物毒性(或胁迫)的基因均属于负向选择体系。常见的正向选择标记体系如下：激素代谢如异戊烯基转移酶基因ipt、β-葡糖糖苷酸酶基因gus；糖类代谢如木糖异构酶基因xy1A、磷酸甘露糖异构酶编码基因pmi；氨基酸代谢如天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧基合酶编码基因dhps；嘧啶代谢如大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；解除化合物毒性(或胁迫)基因主要包括甜菜碱醛脱氢酶基因badh、有机汞裂解酶基因基因merB和汞离子还原酶基因merA、谷氨酸-1-半醛转氨酶基因gsat；叶绿素合成相关酶如原卟啉原氧化酶编码基因ppox，能产生某些荧光物质的蛋白酶类基因如荧光素酶编码基因luc和绿色荧光蛋白编码基因gfp等，这些筛选基因仍有不足，如在单子叶和双子叶植物中显示筛选效果的差异性，或筛选试剂对植物生长发育有毒性，或某些基因来源于病原细菌等，具有潜在的风险，转基因植物在全世界范围内一些国家仍然明令禁止种植，开发新的安全高效的选择标记基因对于转基因植物的推广和应用具有举足轻重的地位。

高等植物的四吡咯分子代谢是一种多途径分支代谢过程，如图1所示主要是4个分支代谢途径产生4类四吡咯分子：叶绿素(chlorophyll)、血红素(heme)、维生素B12(VitaminB12)和西罗血红素(siroheme)。它们作为酶或蛋白的辅基，在植物生命活动中起重要作用。抑制某些酶的表达会导致前3种卟啉化合物不能合成，导致细胞死亡。因此，它们合成的相关酶如谷氨酸-1-半醛转氨酶作为安全的筛选标记，Gough等将光合细菌编码的该酶基因作为选择标记转化烟草，用3-氨基-2，3-二氨基苯甲酸作为筛选试剂，非转基因后代显示白化苗或死亡，而转基因植株显示绿色，Rosellini等将此基因作为筛选标记转化苜蓿，转化频率比卡那霉素标记的频率高。Rando等发现3-氨基-2，3-二氨基苯甲酸毒害人类神经，抑制人类神经递质的合成，作为筛选试剂的专一性差。原卟啉原IX氧化酶编码基因是另外一个筛选标记，Li等利用拟南芥该酶的突变体编码基因作为筛选标记转化玉米，用二苯醚类除草剂筛选，转基因植株呈现绿色，非转基因植株呈现白化现象，抗除草剂基因的危害前文已有叙述，二苯醚类除草剂已属于淘汰产品，原因是它们在自然界不易降解，数个研究小组发现二苯醚类除草剂毒性很大，导致人类罹患恶性肿瘤。

因此，目前迫切需要发展既可作为转基因植物的来源安全、高效的筛选标记替代目前具有争议的标记基因如抗除草剂标记基因，也可作为指示靶基因的细胞学及组织特异性的定位的报告基因替代传统的绿色荧光蛋白基因gfp、红色荧光蛋白基因asred及荧光素酶基因luc等，但目前国际没有文献及专利报道。