[发明专利]一种判定视网膜细胞死亡进程的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学分析检测领域，涉及一种判定视网膜细胞死亡进程的方法。

背景技术

遗传疾病长期以来一直在困扰着人类，遗传性视网膜退化是一个视网膜细胞迅大量死亡的过程，迅速地导致失明。在世界范围已经开展和正在进行着大量的研究工作，但是对于这种疾病的分子生物学机制、尤其有关视网膜细胞迅速死亡的进程了解并不深刻；为了更好地了解并进而防治这些疾病，大量先进的分子生物学技术正被用于这些疾病的研究。细胞外信号调节激酶(ERK1、ERK2)是一些在细胞分化、增殖等过程中起作用的信号传导系统的重要成员，尽管已经有很多材料证明细胞外信号调节激酶1、2(ERK1/2)在细胞凋亡过程中起着关键性的信号传递、调控基因表达的作用；然而尚没有研究确立了磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平与遗传性视网膜退化过程中细胞异常死亡进程的相关性，也没有以磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平作为遗传性视网膜退化过程中细胞死亡进程的判定依据的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种判定视网膜细胞死亡进程的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种判定视网膜细胞死亡进程的方法，包含如下步骤：

(1)从带有遗传疾病的视网膜组织中分离出核外的总体蛋白；

(2)配制变性聚丙烯酰胺凝胶，核外总体蛋白样品经超声处理后，用聚丙烯酰胺凝胶进行分离；

(3)用Western Blotting检测核外总体蛋白样本中与抗磷酸化细胞外信号调节激酶1和抗磷酸化细胞外信号调节激酶2特异抗体产生免疫反应的抗原蛋白，进行定量分析；

(4)与免疫组织化学确定的细胞死亡曲线比对，从而判定视网膜细胞死亡进程。

步骤(1)从带有遗传疾病的视网膜组织中分离出核外的总体蛋白的方法为：在含多种蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液中将组织匀浆；低速离心，沉淀细胞核，收集上清液，即为核外总体蛋白样本。

所述的含多种蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液配方为：

步骤(3)是将电泳分离后的蛋白从凝胶上转移至硝酸纤维滤膜；用抗磷酸化细胞外信号调节激酶1、2的抗体与转移至硝酸纤维滤膜上的蛋白反应；荧光标记与抗体结合的抗原蛋白条带，对其进行定量分析。

有益效果：

本研究中首次确立了磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平与遗传性视网膜退化过程中细胞异常死亡进程的相关性，首次确认磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平作为遗传性视网膜退化过程中细胞死亡进程的判定依据。这一发现为阐明遗传性视网膜退化的分子生物学机制以及防治这些遗传疾病提供关键性的重要信息，为临床遗传性视网膜退化的诊断提供了参考数据。本方法中采用蛋白印迹法(Western Blotting)是以特异的抗原/抗体反应作为基本检测手段；具有特异性强、灵敏度高、样品用量小、结果明确、重复性好等优点。可以预见，细胞外信号调节激酶(ERK)以及其他信号传递系统应该在遗传病研究、防治中得到进一步的重视。

附图说明

图1：经Western Blotting检测的网膜组织样品中磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)的水平。

A  光照4小时后，采自正常动物，受保护的右眼样品，

B  光照4小时后，采自正常动物，受光照的左眼样品，

C  光照后1小时后，从实验动物采集受保护的右眼样品，

D  光照后1小时后，从实验动物采集受光照的左眼样品，

E  光照后4小时后，从实验动物采集受保护的右眼样品，

F  光照后4小时后，从实验动物采集受光照的左眼样品，

G  光照后24小时后，从实验动物采集受保护的右眼样品，

H  光照后24小时后，从实验动物采集受光照的左眼样品，

光照1小时后视网膜试验样本中细胞才开始死亡，所以样品D中P-ERK1/2不明显高于样品C。3-5小时期间大量细胞迅速死亡(70％细胞在此时间段内死亡)，磷酸化细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平在F样品中极大升高，数倍于对照样品E。12小时细胞死亡过程基本停止，因为95％以上视网膜细胞已经死亡。24小时以后，其细胞死亡过程已结束；样品H中细胞外信号调节激酶1、2(P-ERK1/2)水平与受保护的、没有发生视网膜细胞死亡的G样品相相似。