[发明专利]抗水稻白背飞虱的枯草芽胞杆菌工程菌及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种水稻内生枯草芽胞杆菌，同时还涉及一种枯草芽胞杆菌工程菌的制备方法，还涉及一种抗水稻白背飞虱的枯草芽胞杆菌工程菌的用途。

背景技术

稻飞虱是我国水稻最重要的害虫，对我国当前水稻生产已形成严重威胁。稻飞虱为同翅目害虫，刺吸水稻的汁液，受害植株由于输导组织的破坏，养分不能正常上送，影响生长和发育，造成茎秆细弱，植株矮小，籽粒不饱满，禾苗逐渐枯萎以致死亡。此外稻飞虱通过口器刺入时产生伤口，通过伤口传播多种病毒，而造成水稻的严重损失。

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内，被感染的宿主植物不表现出外在病症，并且可以分离到或者可以从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。植物内生菌包括植物内生细菌、内生真菌和内生放线菌。人们发现植物体内存在大量有益的内生菌在植物体内能产生多种生物学作用，例如可以提供植物所需要的营养物质如氮源及一些激素，能够促进植物快速生长，参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的的能力等。已发现内生菌对宿主植物的有益作用有：固氮作用、促生长、抗病原真菌和细菌、抗逆境、抗动物摄食及他感作用等。植物内生菌的生物多样性决定了其产生的活性物质的多样性。近年来人们从植物内生菌中分离到如下的活性物质：生长调节剂、抗菌活性物质、抗虫活性物质、抗肿瘤活性物质。

凝集素是动物和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质，常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，它是一类非免疫原的，含有1个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白。PNA分布广泛，高等植物中约有14％的植物含有凝集素。人们已经从豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、石蒜科、天南星科等植物中发现了1000多种PNA。目前已克隆了200多个PNA基因，对它们的性质、结构、功能进行了大量研究，发现有些凝集素对鳞翅目害虫、鞘翅目害虫及同翅目害虫如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等刺吸式口器害虫具有明显的致死作用。半夏凝集素(Pinellia ternate agglutinin，PTA)是从三叶半夏中分离的凝集素蛋白，抗虫实验表明，PTA粗提液对刺吸式口器的同翅目害虫具有明显的抗虫性。半夏总蛋白在1mg/ml时对褐飞虱的抑制作用达80％，见参考文献(梁永恒，刘小川，傅强，两种半夏蛋白及凝集素抑制褐飞虱与番茄花叶病毒初报，湖南农业科学，2007，2：93-95)。pta是一种有重要应用价值的抗虫基因。将pta基因改造后导入其它植物体内，将PTA的抗虫性赋予作物，目前转pta基因植物主要有水稻、烟草、中草药菘蓝、百合等。转基因植物虽已应用于多种农作物的品种改良中，但仍存在一些弊端，如：转基因沉默、基因漂移、某些植物组培技术和转基因技术难于操作，如水稻、棉花等。而用植物内生菌作为载体，构建重组菌，在植物体内表达外源蛋白，从而赋予植物新的特征是另一种较好的选择，具有如下优点：内生菌相对植物，易于进行遗传操作；内生菌易于发酵，进行批量生产，可大规模应用于农业生产；内生菌使用方便，操作简单，可通过灌根、浸种等方式施用于田间；内生菌在植物体内可大量繁殖，可达到10⁶-10⁸CFU/g，有利于外源蛋白的大量表达。目前，已有多种抗性蛋白在植物内生菌中实现了表达，如苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry3A转化入甘蔗内生固氮菌Gluconacetobacter diazotrophicus，Herbaspirillum seropedicae中，用于控制鞘翅目和鳞翅目昆虫，见参考文献(Salles，J.F.，Gitahy，P.M.，L.，Baldani，J.I.，2000.Use of endophytic diazotrophic bacteria as a vector to express the cry3A gene from Bacillus thuringiensis.Braz.J.Microbiol.31，155-161)。

我们将有杀虫活性的pta基因导入水稻内生菌中，以构建兼具杀虫作用、且持效期长的内生工程菌，该重组菌将对同翅目害虫有显著抗性，并且由于该菌株是一类植物内生菌，在植物体内定殖后，能长期发挥功效，具有稳定、持效期长的优点，该项研究一方面顺应了利用现代生物技术开发新型生物农药的大趋势，另一方面，也将给我国生物农药的开发研制注入新的活力和新的竞争力。

发明内容