[发明专利]基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的外源基因诱导表达调控系统及其构建方法

权利要求书

1.一种基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，其是由BS-BirA与VP16核心转录激活结构域的四个串联重复VP4相融合的转录激活因子。

2.根据权利要求1所述的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，所述外源基因诱导表达调控系统由调控载体pc-BS-BV和响应载体pc-Hy-BSOB-minE组成；所述调控载体pc-BS-BV结构如图3所示，所述响应载体pc-Hy-BSOB-minE结构如图5所示。

3.根据权利要求2所述的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，所述调控载体pc-BS-BV含有序列表中SEQ ID No.1所示的BS-BirA。

4.根据权利要求3所述的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，所述调控载体pc-BS-BV还含有序列表中SEQ ID No.2所示的VP16核心转录激活结构域的四个串联重复VP4。

5.根据权利要求4所述的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，所述响应载体pc-Hy-BSOB-minE具有长度约为120bp的CMV启动子片段。

6.根据权利要求5所述的外源基因诱导表达调控系统，其特征在于，所述响应载体pc-Hy-BSOB-minE具有序列表中SEQ No.3所示的BSOB 4个串联重复序列。

7.一种基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的外源基因诱导表达调控系统的构建方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

(1)调控载体pc-BS-BV的构建：利用SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示引物从BS168基因组中扩增得到BS-BirA基因，序列如SEQ ID No.1所示；Kpn I/Not I酶切pc-Hy-GVP4载体，得到单纯疱疹病毒转录激活结构域核心序列的4个串联重复VP4，序列如SEQ ID No.2所示，VP4序列与上述BS-BirA序列进行重叠PCR，得到的融合蛋白BS-BV通过Afl II/Not I酶切位点连入pcDNA3.1(+)载体；

(2)响应载体pc-Hy-BSOB-minE的构建：利用pTRE质粒及SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示引物扩增得到CMV启动子，通过Mfe I/Mlu I位点连入pc-Hy-E载体，得到启动子弱化的EGFP表达载体pc-Hy-minE；通过单链寡核苷酸退火获得1～4个拷贝BSOB序列；将该片段连入Mfe I/Mlu I酶切的pc-Hy-minE，得到含1～4个拷贝BSOB的BS-Biotin-On响应载体pc-Hy-BSOB-minE；

(3)将该调控载体pc-BS-BV和该响应载体pc-Hy-BSOB-minE共转染HEK293细胞。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，通过单链寡核苷酸退火获得BSOB片段后，通过全合成获得4个串联重复的BSOB序列，经Nru I/Mlu I酶切后连入同样酶切的pc-Hy-minE载体，得到含4个拷贝BSOB的BS-Biotin-On响应载体pc-Hy-4BSOB-minE。