[发明专利]基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的外源基因诱导表达调控系统及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物素诱导表达系统，具体地说是一种基于枯草芽孢杆菌连接酶(BS-BirA)的外源基因诱导表达调控系统及其构建方法。

背景技术

外源基因表达调控系统现已广泛应用于基础研究和应用研究中，包括功能基因组研究、组织工程、药物研发、基因治疗和生物药物生产等领域。第一代用于哺乳动物细胞的基因表达调控系统采用具有药理学活性的诱导剂分子，如抗生素、免疫抑制剂或激素及其衍生物。尽管这些条件表达系统在培养中和转基因动物中表现出了良好的调控效果，但这些诱导剂分子在临床上副作用和产生抗生素抗性病原体的可能性使其在基因治疗和生物药物生产中的应用始终未获批准。新一代的外源基因调控系统采用临床上惰性的诱导剂分子，如精氨酸、生物素、气态乙醛等。其中，生物素又称维生素H，是一种水溶性B族维生素，是动物机体维持正常生理机能所必需的维生素之一，它绝对无毒(尚未观察到LD₅₀和任何副作用)、价格低廉，并且是FDA批准的用于生物制药的生产培养基的成分，因此是一种理想的诱导剂分子。

大肠杆菌生物素连接酶BirA(EC-BirA)是发现最早、研究得最清楚的生物素连接酶。EC-BirA是一个双功能蛋白：1)在ATP存在下，通过与AMP连接激活生物素(biotinyl-5’-AMP)，并将生物素基团转移至乙酰辅酶A羧化酶的生物素羧基载体蛋白亚基上；2)与biotinyl-5’-AMP结合，发生构象变化，从而能够结合位于生物素合成操纵元启动子上游的特异操纵子序列，抑制生物素合成操纵元的转录。突变实验表明，DNA结合结构域位于EC-BirA的N-末端，而酶活性和生物素结合位点位于中间结构域，BirA以两个单体的形式结合于一个40bp不完全对称的回文序列上。2009年，Weber等利用EC-BirA的上述性质建立了一种响应于生物素的外源基因诱导表达系统，以SEAP为报告基因，在多种细胞系(CHO-K1、HEK293-T和COS-7)中验证了良好的响应于生物素的诱导表达效果。在该系统中EC-BirA与单纯疱疹病毒VP16蛋白的转录激活结构域融合，形成依赖生物素的嵌合转录激活因子BirA-VP16。在生物素存在下，BirA-VP16结合于特异的操纵子序列，激活下游最小真核启动子的转录；无生物素时，转录激活因子不能结合，最小启动子无法启动目的基因的转录。

另一个研究得较多的生物素连接酶是来自革兰氏阳性细菌的BS-BirA，BS-BirA含325Aas，分子量为36.2KDa。该蛋白具有与EC-BirA类似的双功能特性，是枯草芽孢杆菌生物素操作元的抑制因子，并且具有生物素连接酶活性，能够补偿E.coli的条件致死birA突变。但是，BS-BirA的氨基酸序列与EC-BirA仅有27％的同源性，在与该蛋白的转录抑制因子功能有关的三个关键位点中，DNA结合结构域与EC-BirA同源性较低，二者相应的操纵子序列也不同；生物素结合位点二者一致；ATP结合位点有所不同(BS-BirA中为GRGRMS，EC-BirA中为GRGRRG)。以上差异可能会造成BS-BirA与EC-BirA在操纵子序列结合的特异性及对生物素响应的灵敏性等方面的不同。2009年，Weber等建立了一种新型的基于大肠杆菌生物素连接酶、以生物素为诱导剂的基因表达调控系统，

发明内容

本发明的目的是提供一种与生物制药工艺兼容的外源基因诱导表达系统——BS-Biotin-On系统。具体地说是一种基于枯草芽孢杆菌连接酶(BS-BirA)的外源基因诱导表达调控系统。

本发明的另一个目的是提供上述BS-Biotin-On系统组成元件的序列，其具有序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所述的序列。

本发明的再一目的在于提供一种上述BS-Biotin-On系统的构建方法。

为实现上述目的，本发明的发明思路为：

从枯草芽孢杆菌基因组中通过PCR的方法扩增生物素连接酶基因，将其与VP16转录激活结构域核心序列的4个串联重复进行重叠延伸，获得二者的融合序列BS-BV，该序列连入表达载体得到BS-Biotin-On系统的调控载体；从pTRE载体上扩增最小CMV启动子，用以替换EGFP组成型表达载体中的野生型CMV启动子，并在其上游连入不同拷贝数的BS-BirA特异操纵子(BSOB)序列，得到BS-Biotin-On系统的响应载体；将调控载体和响应载体共转染HEK293细胞，借助流式细胞仪考察不同生物素浓度下EGFP的荧光强度情况，验证BS-Biotin-On系统的效果。