[发明专利]苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为：

步骤a：

苯妥因衍生物的活化：将特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、10mM pH为5.0的磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解，反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于10mL0.2M pH为8.5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。

2.按权利要求1所述的抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤a：

苯妥因衍生物的活化：将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700μL纯二甲基酰胺、700μL无水乙醇、1.4mL 10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液、80mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将40mg牛血清白蛋白溶解于10mL 0.2M pH8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原。

3.按权利要求1所述的抗苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤c为：用0.2M的pH为8.5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至1.0mg/mL，然后用1.0mL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2～3周后，再用1.0mL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。

4.苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有R1试剂、R2试剂、定标液，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：R1试剂的制备，R2试剂的制备，定标液的制备，

所述R1试剂的制备为：

步骤a：苯妥因衍生物的活化，将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700μL纯二甲基酰胺、700μL无水乙醇、1.4mL 10mM pH为5.0的磷酸钾缓冲液、80mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将40mg牛血清白蛋白溶解于10mL 0.2M pH为8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体；

步骤d：在1LTris缓冲液中依次加入2.02g脱氢辅酶I和0.86g葡萄糖-6-磷酸，在室温下搅拌10分钟，所述Tris缓冲液pH为8.0，所述Tris缓冲液中各组分浓度为55mMTris、质量体积百分比为0.1％的牛血清白蛋白、145.4mM NaCl、3mM MgCl₂，然后将步骤c中苯妥因衍生物特异多克隆抗体的制备中得到的抗体加入该溶液中，稀释比例为1∶1000-1∶6000，得到R1试剂；

所述R2试剂的制备方法为：

步骤a、将30mg葡糖糖六磷酸脱氢酶，溶解于24mL 0.05M的Tris缓冲液中，然后依次加入200-500mg还原型辅酶I、1.0-2.0mL的卡必醇和2.0-6.0mL的二甲基亚砜混匀；

步骤b、将20mg的苯妥因衍生物溶解于840μL二甲基亚砜和360μL纯二甲基酰胺的混合溶液中，加入12μL三丁胺和6μL氯甲酸异丁酯，在2～8℃条件下搅拌30分钟；

步骤c、将步骤a和步骤b得到的两种溶液混合，在2～8℃条件下搅拌过夜，得到偶联的酶标抗原，再进行G-25凝胶层析柱纯化得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯妥因偶联物；

步骤d、将步骤c中的葡糖糖六磷酸脱氢酶苯妥因偶联物酶标抗原稀释于Tris缓冲液中，稀释比例为1∶400-1∶3000，得到R2试剂；所述Tris缓冲液pH为8.2，所述Tris缓冲液中各组分浓度为120mM Tris、质量体积百分比为0.1％的牛血清白蛋白、145.4mM NaCl、3mM MgCl₂；

定标液的制备方法为：将苯妥因校准品溶于空白血清中配制成一系列浓度的标准品。