[发明专利]苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

癫痫是一种常见的神经系统疾病，也是我国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症。目前，抗癫痫类药物仍然是控制癫痫发作的主要手段。传统的抗癫痫类药物苯妥因治疗窗窄、个体差异大、疗效和毒性反应与血药浓度密切相关，临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度。因此，苯妥因血药浓度的监测对癫痫的诊断和治疗具有重要的临床指导意义。

目前，国内外测定苯妥因血药浓度的方法主要是高效液相色谱(HPLC)、荧光偏振免疫分析(FPIA)、微粒酶免法、免疫比浊法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法。采用HPLC法，需要样本前处理，操作相对复杂、且检测成本昂贵；ELISA检测法灵敏度较高，但无法精确定量；荧光偏振免疫分析(FPIA)具有操作简单、灵敏度高等优点，但试剂成本高，不适合常规治疗药物的检测，阻碍个性化治疗的推广。

因此开发一种操作简便、周期短、成本低、灵敏度高的检测方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的苯妥因多克隆抗体及苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供苯妥因特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为：

步骤a：

苯妥因衍生物的活化：将特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入纯二甲基酰胺、无水乙醇、10mM pH为5.0的磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白溶解于10mL0.2M pH为8.5的磷酸缓冲液中得到溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，得到偶联的苯妥因抗原，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体。

优选的所述步骤a为：

苯妥因衍生物的活化：将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700μL纯二甲基酰胺、700μL无水乙醇、1.4mL 10mM pH为5.0的磷酸钾缓冲液、80mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将40mg牛血清白蛋白溶解于10mL0.2M pH8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

优选的，所述步骤c为：用0.2M的pH为8.5的磷酸缓冲液将合成的所述步骤b中的苯妥因免疫抗原稀释至1.0mg/mL，然后用1.0mL的苯妥因免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射，2～3周后，再用1.0mL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对家兔注射一次，之后每隔28天注射一次，注射两次后，获得苯妥因特异性多克隆抗体。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的另一个技术方案是提供苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒上设置有R1试剂、R2试剂、定标液，所述苯妥因均相酶免疫检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：R1试剂的制备，R2试剂的制备，定标液的制备，

所述R1试剂的制备为：

步骤a：苯妥因衍生物的活化，将20mg特异的苯妥因衍生物置于容器中，并依次加入700μL二甲基酰胺、700μL乙醇、1.4mL 10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液、80mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和10mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌溶解反应30分钟；

步骤b：抗原的偶联和纯化：将40mg牛血清白蛋白溶解于10mL0.2M pH为8.5的磷酸缓冲液中得到牛血清白蛋白溶液A，将步骤a活化的苯妥因衍生物滴加到所得的牛血清白蛋白溶液A中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将得到的偶联的苯妥因抗原进行透析纯化，得到苯妥因免疫抗原；

步骤c：采用步骤b得到的苯妥因衍生物免疫抗原免疫动物，得到苯妥因特异性多克隆抗体；