[发明专利]斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法及其应用

权利要求书

1.一种活体斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)斑马鱼选取

挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；

(2)化合物处理

移除微孔板中的培养液，设置多个实验组，每个实验组包括1个罗丹明B处理组、1个Pgp抑制阳性对照组和1个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；

(3)图像分析和/或微孔板分析。

2.一种评价P-糖蛋白抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)斑马鱼选取

挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；

(2)化合物处理

移除微孔板中的培养液，设置多个实验组：若干个化合物组合处理组、模型组、Pgp抑制阳性对照组和空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；

(3)图像分析和/或微孔板分析。

3.一种筛选P-糖蛋白抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)斑马鱼选取

挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；

(2)化合物处理

移除微孔板中的培养液，设置多个实验组：若干个化合物组合处理组、模型组、Pgp抑制阳性对照组和空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；

(3)图像分析和/或微孔板分析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的罗丹明B处理组中加入的溶液为罗丹明B溶液，所述的Pgp抑制阳性对照组中加入的溶液为与罗丹明B处理组等体积的罗丹明B与环孢菌素A的混合溶液，混合溶液中罗丹明B的浓度与罗丹明B处理组中相同，环孢菌素A的浓度为10mM.

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中斑马鱼为受精后4小时(4hpf)的斑马鱼，所述步骤(2)化合物处理中斑马鱼培养24小时。

6.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于：所述化合物组合处理组中加入的溶液为罗丹明B和待测化合物的混合溶液，模型组中加入的溶液为罗丹明B溶液，Pgp抑制阳性对照组中加入的溶液为罗丹明B和环孢菌素A的混合溶液，其中化合物组合处理组、模型组、Pgp抑制阳性对照组中罗丹明B的浓度相同。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)图像分析步骤如下：处理一段时间后，每组随机选取若干尾斑马鱼，利用立体荧光显微镜侧位拍照并保存，一方面通过观察对比各实验组斑马鱼荧光强度可定性评价环孢菌素A对Pgp的抑制效应，另一方面利用图像处理软件对图像进行定量分析，计算斑马鱼荧光强度，环孢菌素A对Pgp的抑制效应计算公式如下：

所述步骤(3)微孔板分析步骤如下：处理一段时间后，将斑马鱼转入96孔板，每孔1尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，环孢菌素A对Pgp的抑制效应计算公式如下：

8.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)图像分析步骤如下：处理一段时间后，每组随机选取若干尾斑马鱼，利用立体荧光显微镜侧位拍照并保存，一方面通过观察对比各实验组斑马鱼荧光强度可定性评价定性评价或筛选Pgp抑制剂，另一方面利用图像处理软件对图像进行定量分析，计算斑马鱼荧光强度，待测化合物对Pgp的抑制效应计算公式如下：

所述步骤(3)微孔板分析步骤如下：处理一段时间后，将斑马鱼转入96孔板，每孔1尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，待测化合物对Pgp的抑制效应计算公式如下：

9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述的步骤(2)化合物处理中斑马鱼于28℃下恒温培养，所述的空白对照组中使用的溶液为斑马鱼养殖用水。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述化合物组合处理组、模型组、Pgp抑制阳性对照组中罗丹明B浓度为50mM，Pgp抑制阳性对照组中环孢菌素A浓度为10mM，化合物组合处理组一共设置5个，5个化合物组合处理组中待测化合物浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μM。