[发明专利]斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选(评价)领域，具体涉及一种简单、经济、高通量的斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法以及利用该动物模型筛选与评价P-糖蛋白抑制剂的方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病。据世界卫生组织(WHO)报道，目前全世界每年新发现癌症患者约1000万，死于癌症的人数600～700万，而在中国近20年来的癌症死亡率上升了近30％^[1]。

化疗是治疗癌症的重要手段，但化疗中常见且难以解决的问题是肿瘤多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)的产生，即肿瘤细胞在化疗药物或其他因素的作用下，对多种化学结构相似或不同的抗癌药物产生耐药性^[2]。MDR形成的最主要的分子机制是肿瘤细胞多药耐药基因MDR1高表达，MDR1基因是ABC基因家族的一个亚族，其编码产物为P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)。Pgp为跨膜糖蛋白，分子量为170～180KD，Pgp能够与进入细胞浆的抗肿瘤药物结合，借助ATP水解释放出的能量，直接或间接将药物泵出细胞；或借Pgp本身的通道作用，将药物从细胞内泵出细胞外，导致肿瘤细胞内药物浓度降低、细胞毒性或靶向治疗作用减弱或丧失，进而使肿瘤细胞产生耐药性^[3]。因此，使用Pgp抑制剂是逆转MDR的一个重要手段。近年来，评价与筛选Pgp抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的前沿热点之一。

建立Pgp抑制剂筛选模型对于评价与筛选Pgp抑制剂至关重要。目前Pgp抑制剂筛选模型主要有两大类，一类是体外细胞模型，另一类是体内耐药动物模型。体外细胞模型研究是利用肿瘤耐药细胞株来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等^[4-8]。该模型研究方法虽然简单、所需费用较低，但体外细胞缺少药物在生物整体内的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况，对Pgp抑制剂的实际疗效预测性差。体内耐药动物模型的建立主要通过原位移植^[9]、皮下移植^[10]和腹腔移植^[11]三种途径。通常认为原位移植优于皮下移植，主要是由于能够模拟体内的器官微环境，虽能更好的反映肿瘤的形态特点和生物学行为，但由于操作复杂，创伤性大，每次接种数量有限，肿瘤深在不利于观察和治疗的部位，应用受到一定程度的限制；皮下移植法尽管操作简单，易于观察，但肿瘤生长局限，几乎无转移；腹腔移植法由于位置深，难以观察，潜伏期长且肿瘤生长慢。因此建立一种既能很好地模拟药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，又能快速、准确的评价与筛选地Pgp抑制剂的动物模型具有重要意义。

斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85％以上，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低^[12]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点^[12-13]：①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；③生长发育速度快，在受精后24小时(24hpf)，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的疾病模型研究材料。