[发明专利]表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，包括以下步骤：

a)表皮干细胞的分离和培养

取大鼠或小儿包皮全层皮肤，中性蛋白酶消化过夜，从表皮基底层提取单细胞，洗涤后加入DK-SFM培养液，移至用Ⅳ型胶原预包被的培养瓶内，37℃下静置10～15min，贴壁细胞即为表皮干细胞；弃去未贴壁的细胞悬液，加入DK-SFM培养液常规培养，取第2-3代细胞用于实验；

b)采用胶原混合液表面修饰几丁质膜

b-1)胶原混合液的制备

在冰上进行如下操作：将无菌10×PBS、无菌蒸馏水、无菌新鲜1NNaOH混合配制平衡液，然后将I型胶原加入所述平衡液混合均匀；其中按照体积比5mg/ml I型胶原∶10×PBS∶1N NaOH＝0.5～1.5∶0.25～0.75∶0.05～0.15，无菌蒸馏水补足总量，混合后I型胶原的终浓度为0.25～3mg/ml；放置15min获得胶原混合液；

b-2)修饰几丁质膜

根据模具，几丁质膜裁成呈正方形、且双层十字型放置，在其上加入所述胶原混合液，胶原混合液的添加量为0.2～0.4ml/cm²几丁质膜面积，冰上放置30min～1h，然后放置在37℃孵育箱45min～1h，促进胶体形成；之后在温度-70～-80℃下预冷20h或过夜，-30～-40℃冷冻真空干燥20～25h；Co60 5～10Kgy辐照，连续3～5次交联并灭菌而获得修饰几丁质膜；

c)表皮干细胞-修饰几丁质膜共培养

修饰几丁质膜使用时用培养液平衡后待用；贴壁培养的表皮干细胞消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×10⁶～2×10⁶个/ml，表面种植浓缩为0.2～0.5ml细胞悬液，滴加在修饰几丁质膜表面，静置30min～1h后，加入含5～10％胎牛血清的DK-SFM培养液，于37℃、5％CO₂培养箱中，常规培养1～2w，隔天换液，获得表皮干细胞-修饰几丁质膜仿生皮肤覆盖物。

2.根据权利要求1所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-1)中，所述平衡液的pH为6.9～7.2。

3.根据权利要求1所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-1)中，混合后I型胶原的终浓度为0.25～0.5mg/ml。

4.根据权利要求1或3所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-1)中，I型胶原为从大鼠鼠尾、猪筋腱、牛筋腱提取的I型胶原。

5.根据权利要求1所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-1)中，I型胶原与平衡液的混合采用吸管上下吸匀的方式进行温和混合，如有气泡采用离心方式去除。

6.根据权利要求1所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-2)中，采用Co60 5Kgy辐照，连续4～5次交联并灭菌。

7.根据权利要求1所述的表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：所述步骤b-2)中，修饰几丁质膜具有图案式的均匀网格结构，网格孔径为2～10nm。

8.权利要求1-7之一所述表皮干细胞-修饰几丁质膜构建的仿生皮肤覆盖物，其特征在于：用于皮肤组织工程浅层与全层创面修复。