[发明专利]表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程皮肤技术领域，尤其涉及一种以几丁质膜作为支架培养表皮干细胞构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途。

背景技术

大面积创面处理离不开覆盖物，有时甚至需要进行皮肤移植，但自体皮源不足而限制了手术实施。现有技术的人工皮肤研究中，通常使用表皮细胞、成纤维细胞等终末细胞加入支架材料，以构成有一定生物活性的复合皮，但这类终末细胞，增殖能力较弱，影响修复效果。以往组织工程皮肤的种子细胞中，表皮成分主要是来源于自体或异体的表皮细胞，虽然不断改进培养体系，缩短周期或建立表皮细胞株，但尚无突破性进展。真皮种子细胞主要来源于成纤维细胞，取材方便生长速度较快，但功能单一，对构建皮肤附属器无明显优势。由于表皮干细胞(epidermis stem cells，ESCs)具有很大的可塑性，是潜在的多能干细胞，在合适条件下可诱导形成汗腺、毛发和毛囊等皮肤附属器，从而在解决表皮成分的种子细胞上具有优势。而ESCs的培养及其与载体的结合，是构建组织工程皮肤的关键所在。

几丁质膜作为一种生物材料，除了具有良好的组织相容性和生物学性能外，还具有来源广泛、价格低廉、性质稳定及重复性好等优点，是构建组织工程皮肤的较好选择。本发明人以几丁质膜作为介质支架，体外与ESCs共同培养，取得了突破性进展，ESCs在几丁质膜纤维1～2w上形成集落，为ESCs作为种子细胞构建仿生覆盖物并实现诱导组织再生、功能重建提供了基础。但仍然存在着以下缺陷：几丁质生物膜材料孔径较大(500～1000nm)、网格不均匀、致密性差，仅适合用于伤口的暂时性覆盖，不利于细胞的贴附及立体生长，细胞容易遗漏，细胞贴附量有限，从而影响了表皮干细胞分化为表皮细胞的能力，不能很好地促进创面愈合，难以获得理想的创面修复效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种对几丁质膜进行表面修饰改性后与表皮干细胞共同培养构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，使表皮干细胞在支架材料上均匀地、充分铺展并具有良好的生长状态，以利于表皮干细胞在创面中从毛囊干细胞向表皮细胞分化，并产生毛囊等附属器，从而获得理想的创面修复效果，实现病损组织的形态和结构再生、功能重建。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，包括以下步骤：

a)表皮干细胞的分离和培养

取大鼠或小儿包皮全层皮肤，中性蛋白酶消化过夜，从表皮基底层提取单细胞，洗涤后加入DK-SFM培养液，移至用IV型胶原预包被的培养瓶内，37℃下静置10～15min，贴壁细胞即为表皮干细胞(ESCs)；弃去未贴壁的细胞悬液，加入DK-SFM培养液常规培养，取第2-3代细胞用于实验；

b)采用胶原混合液表面修饰几丁质膜

b-1)胶原混合液的制备

在冰上进行如下操作：将无菌10×PBS、无菌蒸馏水、无菌新鲜1N NaOH混合配制平衡液，然后将I型胶原加入所述平衡液混合均匀；其中按照体积比5mg/ml I型胶原∶10×PBS∶1N NaOH＝0.5～1.5∶0.25～0.75∶0.05～0.15，无菌蒸馏水补足总量，混合后I型胶原的终浓度为0.25～3mg/ml；为减少或避免产生气泡，混合采用吸管上下吸匀的方式进行，如出现气泡采用离心方式去除；放置15min获得胶原混合液；

b-2)修饰几丁质膜

根据模具，几丁质膜裁成呈正方形、且双层十字型放置，在其上加入所述胶原混合液，胶原混合液的添加量为0.2～0.4ml/cm²几丁质膜面积，冰上放置30min～1h，然后放置在37℃孵育箱45min～1h，促进胶体形成；之后在温度-70～-80℃下预冷20h或过夜，-30～-40℃冷冻真空干燥20～25h；Co60 5～10Kgy辐照，连续3～5次交联并灭菌而获得修饰几丁质膜；所述修饰几丁质膜具有图案式的均匀网格结构，网格孔径为2～10nm；

c)表皮干细胞-修饰几丁质膜共培养