[发明专利]一种检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于一种检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法，属于动物传染学病领域。

背景技术

自2010年4月以来，一种由黄病毒引起的种（蛋）鸭产蛋骤降的新发疫病在我国江苏、浙江、山东、河南、福建等地相继发生，可致使产蛋鸭采食量迅速下降、产蛋率急速下降、甚至停产及不同程度死亡。产蛋率高的鸭群患病后4~5天左右从产蛋高峰的80%~95%迅速下降至20%~30%，严重的可在发病后7天左右出现停产；刚开产种（蛋）鸭产蛋率上升缓慢或减蛋、长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎100%，病死率为0~12%。其临床症状除了产蛋骤降外，很重要的一个特征是发生鸭卵巢出血的病鸭伴有摇头扭颈等神经症状，剖检病变主要为卵泡膜出血、充血，卵泡变形萎缩等，部分出现脑膜出血。研究人员从表现产蛋骤降的病死种鸭中采集其卵巢、肝脏、脑等进行病毒分离，经对所分离的病毒进行形态学观察、理化特性测定、RT-PCR检测及序列分析明确该病病原为黄病毒科（Flaviviridae）的一个新成员^[1-3]。

明确病因是为了更好地做好防治工作。当务之急，做好鸭黄病毒感染的诊断和免疫防制工作是摆在科研工作者、基层兽医和蛋鸭养殖户面前的一件大事，建立鸭黄病毒抗体检测方法，对该病的主动免疫效果评价、流行病学调查极有意义，而ELISA方法因其检测通量大、结果确切、灵敏度高而倍受欢迎。但该病主要发生在产蛋鸭，若进行血清抗体检测，在采血过程中必然会对产蛋鸭产生应激，影响其产蛋率。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法，该方法通过对鸭所产蛋的卵黄提取抗体，进行免疫检测，可对鸭黄病毒病进行快速诊断，方法简便易行，用以减少损失、提高养殖效益。

本发明采取的技术方案如下：

以鸭黄病毒作为包被抗原，对鸭所产蛋的卵黄提取抗体，建立了检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法。

所述鸭黄病毒为鸭黄病毒（Duck flavivirus）WR株，保藏登记号为CGMCC NO.4906。

所述抗原先经过浓缩，包括如下步骤：收集含有鸭黄病毒的胚尿囊液后于4℃、8000 r/min离心30 min，上清于45000 r/min离心4℃离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70℃。

所述病毒浓缩液经进一步纯化，将病毒浓缩液通过蔗糖梯度离心纯化后经超速离心加以浓缩获得。

进一步纯化的步骤为：制备10%、20%、30%、40%和50%等5个梯度的蔗糖平衡液，将病毒浓缩液加在10%蔗糖液上层，于4℃、40000 r/min水平离心3 h；结果在10%-20%、30%-40%、40%-50%间发现有病毒带，收集各带后4℃下45000 r/min离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬，并用RT-PCR方法检测各带的病毒含量，以30%-40%带病毒量最大，得到病毒纯化液，储存于－70℃为抗原备用。

所述间接ELISA方法包括：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。

根据权利要求6所述的检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述间接ELISA方法的最佳工作条件为：抗原稀释3200倍，样品稀释40倍，酶标二抗稀释浓度为1:3200，阴阳临界值为0.45。

本发明的显著优点：建立的检测鸭黄病毒病卵黄抗体的间接ELISA方法，该方法可以对目前我国流行的鸭黄病毒病进行有效的诊断，并可开展大规模的流行病学调查，为鸭黄病毒病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。

具体实施方式

实施例1

本发明的鸭黄病毒抗原，是通过如下方式获得的：

（1）抗原的浓缩

用半番胚大量培养本研究室分离鉴定的一株具有良好免疫活性的鸭黄病毒WR株（菌株的保藏号CGMCC No.4906，来源于申请人申请的一项发明专利：申请号为201110143407.6，一种鸭黄病毒及其灭活疫苗），收集含有病毒的胚尿囊液后于4℃、8000 r/min离心30 min，上清于45000 r/min离心4℃离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬，得到病毒浓缩液，储存于-70℃。

（2）抗原的纯化