[发明专利]由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法

权利要求书

1.一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于制备步骤包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸/氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。

2.根据权利要求1所述的由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于：冷沉淀用注射用水溶解后，用DEAE Sephadex A50凝胶进行吸附，吸附后的溶液调节pH、电导率和温度，纤维蛋白原和纤维结合蛋白形成沉淀析出，离心分离沉淀和上清液；上清液经过S/D病毒灭活和离子交换层析纯化得到凝血因子Ⅷ；沉淀再溶解后，经过离子交换层析分为流穿液和洗脱液；流穿液经过S/D病毒灭活和2次甘氨酸沉淀得到纯化的纤维蛋白原；洗脱液经过巴氏灭活得到纤维结合蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）冷沉淀用注射用水在15~35℃范围内搅拌溶解，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.6~7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；

（2）步骤1中离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，可以通过离心分离沉淀，而凝血因子Ⅷ则留在上清液当中；

（3）步骤2中离心后的上清液富含凝血因子Ⅷ，经过澄清过滤后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV等；

（4）步骤3中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的凝血因子Ⅷ，大部分杂蛋白从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以除去残留的杂蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脱液可以从层析柱上洗下凝血因子Ⅷ，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到凝血因子Ⅷ制品；

（5）步骤2中离心所得的沉淀含纤维蛋白原和纤维结合蛋白，用含氯化钠、枸橼酸钠和盐酸精氨酸的缓冲液溶解后，经过澄清过滤，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV等；

（6）步骤5中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的纤维结合蛋白，大部分纤维蛋白原则从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以洗掉少量被吸附的纤维蛋白原和残留的聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脱液可以从层析柱上洗下纤维结合蛋白，经过6℃/10h巴氏灭活后，再经过浓缩、配制、除菌、分装可以制成注射液或者滴眼液；

（7）步骤6中层析柱上的流穿液和洗涤液富含纤维蛋白原，向其中加入甘氨酸和氯化钠，纤维蛋白原形成沉淀，通过离心分离沉淀，将聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯留在上清液当中；

（8）将步骤7中所得的纤维蛋白原沉淀溶解后，再加入甘氨酸和氯化钠，再次离心分离沉淀，进一步降低聚山梨酸酯-80和磷酸三丁酯的残留量；

（9）步骤8中所得的纤维蛋白原沉淀溶解，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到纤维蛋白原制品。

4.根据权利要求3所述的由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于：步骤（1）中所述冷沉淀和注射用水的比例在1:2~1:5之间，所述比例是指质量比；步骤（1）中所述DEAE Sephadex A50凝胶的添加量为每千克冷沉淀1~2g干胶，干胶需经过溶胀和平衡后才能使用，平衡方法为：将含10~30mmol/L枸橼酸钠、30~80mmol/L氯化钠、pH为6.6~7.0的平衡液加入溶胀好的凝胶中，搅拌均匀并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。

5.根据权利要求4所述的由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于：步骤（1）中所述冷沉淀和注射用水的比例为1:3。

6.根据权利要求3所述的由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）中所述调节pH过程，加乙酸的速度为100~300ml/min，使用喷雾的方式最佳；步骤（3）和步骤（5）中所述的澄清过滤，要求滤膜的过滤精度≤0.5微米。