[发明专利]由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液制品领域，特别涉及一种能从冷沉淀制备三种血液制品的工艺方法。

技术背景

冷沉淀新鲜冰冻血浆低温融化后析出的一种沉淀组分，富含凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白。血浆中约一半的凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原，以及绝大部分的纤维结合蛋白会富集在冷沉淀当中。

凝血因子Ⅷ是治疗甲型血友病唯一的特效药，在临床上有巨大的应用价值。纤维蛋白原是治疗先天性和获得性纤维蛋白原缺乏症的首选药物。纤维结合蛋白在治疗疱疹性角膜溃疡方面也有较高的临床价值。

目前世界上几乎所有的血浆来源的凝血因子Ⅷ都是从冷沉淀制备得到的；纤维蛋白原多数是由Cohn氏组分Ⅰ制备得到的，也有少部分是由冷沉淀制备得到的；纤维结合蛋白在临床上则直接由冷沉淀代替。

关于冷沉淀制备凝血因子Ⅷ或者纤维蛋白原的报道非常多，而且许多技术方案已经在商业上得到实施。制备纤维结合蛋白的技术方案也非常多，多数为明胶亲和层析。但是由于技术的局限性，还没有任何一种技术方案可以由冷沉淀先后制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白三种血液制品。因为在目前已有的技术方案中，都着眼于一种制品的分离提取和纯化，其他成分都作为杂蛋白被去除，很难再得到利用。

在冷沉淀中，凝血因子Ⅷ是一种微量蛋白，而纤维蛋白原和纤维结合蛋白含量要相对丰富的多。因此如果兼顾纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率，那么凝血因子Ⅷ的收率就会很容易受到影响，这也是目前没有任何已报道的工艺可以同时纯化这三种蛋白质制品的原因之一。

在现有的血液制品工艺当中，冷沉淀多用于凝血因子Ⅷ的制备，因为凝血因子Ⅷ是一种更加珍贵、经济价值更高的蛋白质。由于技术的限制，纤维蛋白原和纤维结合蛋白都会被抛弃。在纯化凝血因子Ⅷ的过程中，要通过沉淀技术将含量相对高得多的纤维蛋白原和纤维结合蛋白从溶液中析出，从而提高凝血因子Ⅷ的纯度。常用的沉淀技术有：甘氨酸沉淀、PEG沉淀、乙醇沉淀、低pH沉淀等。甘氨酸沉淀法需要消耗大量的甘氨酸，成本较高，而且凝血因子Ⅷ会共沉淀而导致收率降低；PEG沉淀法和乙醇沉淀法存在PEG残留或者蛋白质变性的问题；低pH法会导致纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀不完全，纯化效果不好。

 例如发明专利（申请公布号101703763A）公开了一种制备纤维蛋白原的方法，利用冷沉淀经过阴离子交换层析法和甘氨酸沉淀法制备纤维蛋白原，无法获得凝血因子Ⅷ和纤维结合蛋白；发明专利（专利号03115784.X）公开了一种制备纤维结合蛋白的方法，以冷沉淀为原料经过酒精沉淀、PEG沉淀和阴离子交换层析，制得纤维结合蛋白，但是也无法获得冷沉淀中富含的凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原。

血浆（特别是人血浆）或者血浆组分是非常宝贵和稀有的资源，只有尽可能的分离纯化出有医疗价值的蛋白质成分，才能提高血浆的有效利用率。这一类的制备技术显然无法使冷沉淀中的各种有用成分得到充分的利用，实现冷沉淀中多种血浆蛋白的综合开发和利用。

发明内容

本发明提供了一套完整的分离纯化工艺，能够从冷沉淀中先后分别制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白，共三种血液制品。

一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸/氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。

一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括：冷沉淀用注射用水溶解后，在适当的条件下用DEAE Sephadex A50凝胶进行吸附，吸附后的溶液调节至合适的pH、电导率和温度，纤维蛋白原和纤维结合蛋白形成沉淀析出，离心分离沉淀和上清液。上清液经过S/D病毒灭活和离子交换层析纯化得到凝血因子Ⅷ。沉淀再溶解后，经过离子交换层析分为流穿液和洗脱液。流穿液经过S/D病毒灭活和2次甘氨酸沉淀得到纯化的纤维蛋白原；洗脱液经过巴氏灭活得到纤维结合蛋白。

一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，包括以下具体步骤：

（1）冷沉淀用注射用水在15~35℃范围内搅拌溶解，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.6~7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；

（2）步骤1中离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，可以通过离心分离沉淀，而凝血因子Ⅷ则留在上清液当中；