[发明专利]一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及通过采用基因工程方法生产重组人表皮生长因子(rhEGF)。

背景技术

人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，简称hEGF)，是一种由53个氨基酸组成的不含糖基的单链多肽，分子内有三对由6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域，其分子量为6,216道尔顿，等电点(PI)为4.6。

hEGF是人体中一个重要的细胞因子，是类EGF大家族的一个成员，具有多种生物功能，它可促进外胚层和中胚层细胞，如表皮细胞、成纤维细胞、神经细胞的增殖，并可维持其生长；在生物体发育中，EGF可促进新生儿齿、骨和各器官的生长；可促进肝细胞再生；可促进胃肠粘膜细胞生长和保护粘膜免受损伤等等。

rhEGF在临床上主要应用于：(1)促进烧伤、各种外科创伤和手术伤口的愈合；(2)促进外科溃疡的愈合，尤其是糖尿病性溃疡和老烂脚等愈合；(3)用于皮肤、角膜移植；(4)治疗角膜损伤和溃疡；(5)促进胃、十二指肠溃疡愈合。近年来，技术人员还将其用于鳞状细胞癌、皮肤癌的治疗，疗效显著。

由于EGF分子内含有三对二硫键，因此对酸、碱、热等理化因素均较为稳定，它是迄今发现的最稳定的多肽。基础研究表明，EGF具有对皮肤表皮基底层细胞的激活作用，能在分子水平上对细胞进行修复和调整，促进皮肤细胞的新陈代谢，并调节细胞中色素的平衡，可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年来也被应用于化妆品和美容行业。

目前，大规模制备重组hEGF(rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统和酵母表达系统等。

本发明人在先前的研究中，主要将精力放在采用大肠杆菌表达系统分泌表达rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，将含有大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和信号肽的质粒pAE-8，转化大肠杆菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。该工程菌株在低磷条件下诱导表达rhEGF，最高表达量为150mg/l(中国专利号CN00127953.X)；又如，将化学合成全新设计的phoAspL10基因及其与hEGF的串联基因，构建表达质粒pBL10EGF(该质粒含有入噬菌体的P_L启动子)，进而以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞构建工程菌株BE-2，该菌株采用温度诱导的方式，分泌表达rhEGF至384mg/l(中国专利号CN200510025289.3)。

然而，鉴于市场对于hEGF的需求量很大，本领域还有必要进行更优化的研究，以期进一步提高重组hEGF的产量、简化生产过程或降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用温度诱导生产重组人表皮生长因子的方法；以及用于高效表达重组人表皮生长因子的构建物。

在本发明的第一方面，提供一种用于重组表达人表皮生长因子(hEGF)的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件：

噬菌体P_L启动子，OmpA信号肽基因，人表皮生长因子基因。

在一个优选例中，所述的噬菌体P_L启动子来源于pBLGlu2；和/或

所述的OmpA信号肽基因和人表皮生长因子基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的噬菌体P_L启动子和OmpA信号肽基因之间具有限制性内切酶EcoRI酶切位点。

在另一优选例中，所述的人表皮生长因子基因的下游具有限制性内切酶HindIII酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程菌，其包含前面任一所述的构建物。

在另一优选例中，所述的基因工程菌是大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的基因工程菌具有氨苄青霉素抗性。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达人表皮生长因子的方法，包括：培养所述的基因工程菌，从而表达人表皮生长因子。

在另一优选例中，先在30℃±2℃(较佳地30±1℃)繁殖基因工程菌至菌体OD₆₆₀值超过30；之后升高培养温度至38.0±0.5℃(较佳地38.0±0.2℃)，使基因工程菌中所含噬菌体P_L启动子启动，诱导分泌表达人表皮生长因子。

在另一优选例中，诱导表达12±2小时；较佳地12±1小时。