[发明专利]一种NK和/或NKT细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK和/或NKT细胞的培养方法。

背景技术

NK细胞，是骨髓来源的淋巴细胞，可以识别并杀死病毒感染的细胞或转化的恶性细胞。NK细胞是体内快速反应细胞，能迅速被募集至损伤部位，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的功能是其他免疫细胞无法替代的，其杀伤肿瘤细胞的效应无MHC限制，因此称为自然杀伤活性；而且，NK细胞通过分泌IFN-gamma以及与DC相互作用促进Th1型T细胞活化。体外培养的NK细胞包括CD56弱表达和CD56强表达伴随CD16表达或不表达细胞群。CD56强表达细胞群通过非MHC限制途径杀伤肿瘤细胞；而CD56弱表达且CD16+细胞群则通过CD16-Fc途径直接产生ADCC，且肿瘤相关抗原的刺激能进一步促进ADCC。鉴于NK细胞在抗肿瘤免疫中的重要功能，有必要开发一种有效的体外培养并大量扩增具有肿瘤杀伤活性的NK细胞的方法。

现有的NK细胞体外培养方法尽管已比较成熟，能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。IL-2、IL-15和IL-7可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。此外，一些研究还发现这三种细胞因子与NK细胞的分化相关。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增10倍左右，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。

RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的专利产品，属于重组人纤维连接蛋白片段，它含有人纤维连接蛋白CS-1位点和central cell-binding domain，分子量约为63K，其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-1site及central cell-binding domain可与T细胞表面的VLA结合，从而刺激细胞大量繁殖。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培养NK和/或NKT细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；

所述培养体系A为如下1)或2)：

1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；

2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。

所述抗CD3抗体与所述培养基的配比为5μg∶5ml；

所述Retronectin与所述培养基的配比为25μg∶5ml；

所述诱导因子为IL-2和IL-15；

所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml；

所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。

1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供：

每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备：将25μg Retronectin、5μg抗CD3抗体和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；

2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供：

每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备：将25μg Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7.2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml；

所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为35℃-38℃，所述培养温度具体为37℃，所述培养所需CO₂的浓度为4.5％-5.5％(体积百分含量)，所述培养所需CO₂的浓度具体为5％(体积百分含量)。

在所述培养步骤后，还包括如下步骤：

将所述培养得到的细胞移入不含有抗CD3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞；

所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗CD3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。

所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。

所述培养基为10％(体积百分含量)离体血浆的T503培养基，即为10％(体积百分含量)自体血浆的T503培养基；

所述抗CD3抗体为单抗或者多抗；