[发明专利]一种具抗β-乳球蛋白过敏效果的乳杆菌完整肽聚糖的制备方法、产品及其应用

权利要求书

1.乳杆菌完整肽聚糖在制备抗β-乳球蛋白过敏免疫增强剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于是将所述的乳杆菌完整肽聚糖应用于制备抗IgE介导的β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的完整肽聚糖是从约氏乳杆菌KLDS1.7032中提取的，所述的约氏乳杆菌KLDS1.7032，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5050。

4.一种制备权利要求3所述的完整肽聚糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)菌体的清洗与收集：将约氏乳杆菌KLDS1.7032菌种活化传代后，接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养18h，培养完毕后迅速降温至4℃；在5000g、4℃离心20min，收集菌体沉淀；4℃蒸馏水反复洗涤至菌体白色，收集菌体，置于100℃沸水水浴箱中灭活30min，得到热致死菌泥；

所述的约氏乳杆菌KLDS1.7032，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5050；

(2)去磷壁酸：将步骤(1)所述的热致死菌泥悬浮于预热的质量分数为10％三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌体；冷却后，5000g、4℃离心15min，收集沉淀；

(3)脱脂：浓度为0.02mol/L，pH值为4.6的乙酸钠溶液，与氯仿、甲醇，三者按体积比4∶5∶10混合；用混合液溶解步骤(2)得到的沉淀，所述混合液的体积与沉淀体积比为15∶1；室温搅拌18h，8000g、4℃离心20min，收集沉淀；

(4)去蛋白：上述步骤(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀体积的含有3mg/mL胰蛋白酶和3mg/mL碱性蛋白酶的pH 8.0的0.1mol/L磷酸缓冲液，37℃水浴振荡12h，以5000g、4℃离心5min，沉淀用去离子水洗2次；

(5)提纯：步骤(4)得到的沉淀经0.01mol·L^-1硫酸溶液85～95℃处理5min，冰水浴中立即冷却，12000g、4℃离心30min后弃上清，沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析7天，冷冻干燥后置4℃保存备用。

5.按照权利要求4所述的制备方法制备得到的乳杆菌完整肽聚糖。

6.一种抗β-乳球蛋白过敏的微乳制剂，其特征在于包括有效剂量的权利要求3或5所述的完整肽聚糖作为活性成分、还包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和水。

7.如权利要求6所述的微乳制剂，其特征在于所述的表面活性剂为吐温-80，所述的助表面活性剂为无水乙醇，所述的油相为正丁酸乙酯和维生素E的混合物。

8.如权利要求7所述的微乳制剂，其特征在于微乳制剂包括以下重量分数的各物质：权利要求3或5所述的完整肽聚糖3.00％，质量比为7∶3的正丁酸乙酯和维生素E组成的混合物1.07％～13.59％，质量比为2∶8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2.10％～25.42％及水58.00％～89.00％。

9.如权利要求8所述的微乳制剂，其特征在于是由以下方法制备得到的：将质量比为2∶8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2.10％～25.42％分散于58.00％～89.00％水中成水相，质量比为7∶3的正丁酸乙酯和维生素E的混合物1.07％～13.59％为油相，权利要求3或5所述的完整肽聚糖3.00％加入油相中，两相分别预热至70℃，将油相和水相混合后经高速剪切乳化机在6000rpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍体积的生理盐水稀释6倍，再采用高压均质机在70MPa的压力下均质6次，调节pH至6.5～6.8，流通蒸汽灭菌15min，即得微乳制剂。

10.权利要求6-9任一项所述的微乳制剂在制备抗β-乳球蛋白过敏免疫增强剂中的应用。