[发明专利]一种具抗β-乳球蛋白过敏效果的乳杆菌完整肽聚糖的制备方法、产品及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肽聚糖的制备方法和应用，特别涉及一种乳杆菌的完整肽聚糖的制备方法，还涉及由该完整肽聚糖制备成的微乳制剂，其制备方法及其在制备抗β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中的应用。属于生物制药领域。

背景技术

牛乳营养丰富，是婴幼儿重要的食物蛋白来源。但据国外流行病学调查表明，2％～6％的儿童对牛乳产生过敏反应，严重影响其对优质乳蛋白的吸收利用。β-乳球蛋白(β-lactglobulin)被视为最主要的牛乳过敏原蛋白之一，β-乳球蛋白对小牛具有类似免疫球蛋白的功能，但对于婴儿来说却是主要的过敏原，容易造成婴儿的过敏反应，β-乳球蛋白主要诱发特异性IgE抗体介导的I型超敏反应，可引起呕吐、腹痛和腹泻等胃肠不适。且过敏引起的胃肠道疾病(如婴幼儿结肠炎)常致儿童生长迟缓。如何减少β-乳球蛋白所致牛乳过敏症已成为现代乳制品生产中急待解决的问题。

申请者三年来在益生菌调节Th1/Th2失衡缓解β-乳球蛋白过敏方面取得了一定的研究成果，筛选到一株对IgE介导的β-乳球蛋白过敏具有较好疗效的约氏乳杆菌KLDS1.7032，并新发现该约氏乳杆菌抗过敏的作用与细胞壁结构的完整性有关，其细胞壁肽聚糖是抑制过敏的主要成分。

目前，对完整肽聚糖的生理功能及功能机制研究的较多，而对其产品制备方法的研究较少。现有细胞壁肽聚糖基本采用注射方式给药，存在口服生物利用度低及过高剂量会引起不良反应的问题。而微乳是一新型理想的药物释放载体。具有透明，稳定吸收完善，靶向释药等特点，并提高了药物疗效，降低毒副作用。临床应用价值日益提高，具有很大的发展前景。因此，本发明将提取的乳杆菌完整肽聚糖制备成微乳制剂，其经口服到达体内后，可自发形成粒径小于100nm的O/W微乳，由于药物以分子形式分散于微乳中，可明显提高药物的释放度，稳定性增加，口服生物利用度是普通制剂的3～4倍，为新型免疫增强剂的工业化生产奠定了一定的理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是公开了乳杆菌完整肽聚糖微乳在制备抗β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中的应用；特别是应用于制备抗IgE介导的β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中。

所述的免疫增强剂可进一步用于抗β-乳球蛋白过敏的药物或食品制备中。

优选的，所述的乳杆菌完整肽聚糖是从约式乳杆菌KLDS1.7032中提取的。

所述的约氏乳杆菌KLDS1.7032，为乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.5050，保藏日期为2011年7月8日。

本发明所要解决的技术问题之二是提供了一种制备乳杆菌完整肽聚糖的方法，具体的包括以下步骤：

(1)菌体的清洗与收集：将约氏乳杆菌菌种活化传代后，接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养18h；培养完毕后迅速降温至4℃。在5000g、4℃离心20min，收集菌体沉淀；4℃蒸馏水反复洗涤至菌体白色，收集菌体，置于100℃沸水水浴箱中灭活30min，得到热致死菌泥；

(2)去磷壁酸：将步骤(1)所述的热致死菌泥悬浮于预热的质量分数为10％三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌体；冷却后，5000g、4℃离心15min，收集沉淀；

(3)脱脂：浓度为0.02mol/L，pH值为4.6的乙酸钠溶液，与氯仿、甲醇，三者按体积比4∶5∶10混合；用混合液溶解步骤(2)得到的沉淀，所述混合液的体积比与沉淀体积比为15∶1；室温搅拌18h，8000g、4℃离心20min，收集沉淀；

(4)去蛋白：上述步骤(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀体积的含有3mg/mL胰蛋白酶和3mg/mL碱性蛋白酶的pH 8.0的0.1mol/L磷酸缓冲液，37℃水浴振荡12h，以5000g、4℃离心5min，沉淀用去离子水洗2次；

(5)提纯：步骤(4)得到的沉淀经0.01mol·L^-1硫酸溶液85～95℃处理5min。冰水浴中立即冷却，12000g、4℃离心30min后弃上清，沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析7天，冷冻干燥后置4℃保存备用。

本发明所要解决的技术问题之三是提供了一种按照以上所述的制备方法制备得到的完整肽聚糖。

本发明所要解决的技术问题之四是提供了一种抗β-乳球蛋白过敏的微乳制剂，其特征在于包括有效剂量的以上所述的完整肽聚糖微乳作为活性成分、还包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和水。