[发明专利]利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法

权利要求书

1. 一种利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），分别制备麻疯树外植体以及农杆菌菌液，再将外植体经农杆菌液浸染后进行共培养；

步骤（2），将共培养后的外植体脱菌后接入筛选培养基C13KC进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基C13KC是含有1.0-3.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.25-1.0mg/L的3-吲哚丁酸、1-50 mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；

步骤（3），将抗性愈伤组织转入分化培养基SR13KC进行培养，分化出抗性不定芽，所述分化培养基SR13KC是含有1.0-3.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.25-1.0mg/L的3-吲哚丁酸、1-50mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；以及

步骤（4），将抗性不定芽转入生根培养基R2KC中进行培养，从而获得转基因植株，所述生根培养基R2KC是含有0.1-1.0mg/L的3-吲哚丁酸，1-50mg/L的卡那霉素，50-200mg/L的特美汀的1/2MS培养基。

2. 如权利要求1所述的利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于：步骤（1）中，共培养时采用C13A固体培养基，该C13A固体培养基是指含1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200μM乙酰丁香酮，20-30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂的MS培养基，pH 5.8-6.0。

3. 如权利要求1所述的利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于：步骤（1）中，麻疯树外植体的制备经由以下步骤：挑选麻疯树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，接种于MS培养基培养萌发，获得子叶，切制成外植体，本步骤中采用的MS培养基含有20-30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH5.8-6.0。

4. 如权利要求3所述的利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于：步骤（1）中，制备麻疯树外植体时，将完整的胚和子叶接种于MS培养基后先暗培养2-4天，再光照培养10-12天，种子即萌发，光照培养条件是：温度23-26℃，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000 lx。

5. 如权利要求2所述的利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于：步骤（1）中，准备农杆菌菌液、浸染及共培养的具体步骤为：

（a）挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养20-24小时，然后按照1：100的体积比转接，震荡培养至对数生长期，OD₆₀₀=0.8-1.0，将菌液转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，采用C13A液体培养基重新悬浮离心收集的农杆菌，调至OD₆₀₀=0.3-0.6，28℃震荡培养1-2个小时，获得农杆菌菌液备用，采用的C13A液体培养基是指含有1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200μM乙酰丁香酮，20-30g/L蔗糖的MS培养基，pH5.8-6.0；

（b）将切好的外植体放入容器中，加入准备好的菌液进行，置于摇床以不高于100转/分的速度震荡5-15分钟进行浸染；以及

（c）取出浸染过的材料，将其置于无菌滤纸上吸除多余的菌液后再接入C13A固体培养基，置于23-26℃黑暗共培养2-4天。

6. 如权利要求1所述的利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于：步骤（2）进一步包括以下工艺步骤：

（a）取出共培养后的外植体，置于灭菌后的无菌吸水纸上，吸去菌液；

（b）将吸去菌液的外植体接入筛选培养基C13KC进行培养，所述筛选培养基C13KC是指MS培养基，含有1.6-3.0mg/L6-苄基嘌呤、0.25-1.0mg/L的3-吲哚丁酸、1-50mg/L卡那霉素、50-200mg/L特美汀、2-3%蔗糖及0.7%琼脂，且pH5.8-6.0；以及

（c）置于23-26℃暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织。