[发明专利]利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及麻疯树的组织培养技术领域及基因工程领域，尤其是指利用卡那霉素作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法。

背景技术

能源危机是当今世界面临的巨大挑战。中国的石油储量仅占全世界的2%，消费量却居世界第二，因此，迫切地需要寻找一种新型的能源来替代目前广泛使用的化石能源。

与化石资源相比，种植能源植物获取生物柴油具有可再生的优势，是解决能源危机的根本途径。目前已发现的能源植物，主要集中在夹竹桃科、大戟科、萝摩科、菊科、桃金娘科以及豆科等。

麻疯树（Jatopha curcas L.），又名小桐子、柴油树，为大戟科，麻疯树属，多年生落叶灌木或小乔木。小桐子种仁含油量高达61.5%，可作为生产生物柴油的原料，是最有可能成为未来替代化石能源的树种，具有巨大的开发潜力。小桐子耐干旱贫瘠，分布于热带、亚热带和雨量稀少、条件恶劣的干热河谷地区，主要分布于中国云南、贵州、四川、广东、广西、海南等地。

植物转基因技术可将外源基因导入植物，定向改造植物性状而日益受到人们的重视。根癌农杆菌介导法是最常用的植物基因转化方法之一。根癌农杆菌含有Ti质粒，其上有一段T-DNA区，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。Ti质粒上含有另一个重要的区域，是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

然而，麻疯树的研究工作起步较晚，关于麻疯树组织培养和遗传转化技术的报道还很少。2010年，Pan等在African Journal of Biotechnology上发表文章，以卡那霉素作为筛选剂，利用农杆菌介导法对麻疯树进行转化。该方法是在筛选阶段不添加卡那霉素而获得转基因植株，然而120株再生植株只有1株生根，成功率太低而不具有实用性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，以便高效地获得转基因植株。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，包括以下步骤：

步骤（1），分别制备麻疯树外植体以及农杆菌菌液，再将外植体经农杆菌液浸染后进行共培养；

步骤（2），将共培养后的外植体脱菌后接入筛选培养基C13KC进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基C13KC是含有1.0-3.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.25-1.0mg/L的3-吲哚丁酸、1-50 mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；

步骤（3），将抗性愈伤组织转入分化培养基SR13KC进行培养，分化出抗性不定芽，所述分化培养基SR13KC是含有1.0-3.0mg/L的6-苄基嘌呤、0.25-1.0mg/L的3-吲哚丁酸、1-50mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；以及

步骤（4），将抗性不定芽转入生根培养基R2KC中进行培养，从而获得转基因植株，所述生根培养基R2KC是含有0.1-1.0mg/L的3-吲哚丁酸，1-50mg/L的卡那霉素，50-200mg/L的特美汀的1/2MS培养基。

进一步地，步骤（1）中，共培养时采用C13A固体培养基，该C13A固体培养基是指含1.0-3.0mg/L 6-苄基嘌呤，0.25-1.0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200μM乙酰丁香酮，20-30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂的MS培养基，pH 5.8-6.0。

进一步地，步骤（1）中，麻疯树外植体的制备经由以下步骤：挑选麻疯树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，接种于MS培养基培养萌发，获得子叶，切制成外植体，本步骤中采用的MS培养基含有20-30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH5.8-6.0。

进一步地，步骤（1）中，制备麻疯树外植体时，将完整的胚和子叶接种于MS培养基后先暗培养2-4天，再光照培养10-12天，种子即萌发，光照培养条件是：温度23-26℃，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000 lx。

进一步地，步骤（1）中，准备农杆菌菌液、浸染及共培养的具体步骤为：