[发明专利]一种从乳汁中纯化溶菌酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种快速、高效的从乳汁中纯化溶菌酶的方法。本发明方法可用于对乳汁中的溶菌酶进行大规模纯化，且纯化效率高、成本低、纯化产品纯度高，适合工业化生产。

背景技术

天然溶菌酶(lysozyme)是一种在动物界和植物界中广泛存在的糖苷酶。1922年Alexander Flemin发现了多种粘液组织和分泌物中存在能够溶解多种革兰氏阳性菌的物质，他将这种溶解因子称为溶菌酶。后来Flemin还发现，溶菌酶在软骨组织和胃的匀浆液、泪液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴细胞中都存在，但是在健康的尿液、脑脊髓或汗液中没有溶菌酶。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性酶，能水解致病菌细胞壁中的黏多糖，它主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

人溶菌酶的分子量为14600kDa，对人的溶菌酶研究发现，它由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，其一级结构氨基酸序列与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。

溶菌酶作为一种存在于生物体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，目前已知的主要作用有：

(1)抗菌消炎作用：溶菌酶的溶菌活性使其在预防和治疗多种细菌性疾病中均有重要作用，如由链球菌家族微生物引起的耳炎、窦炎、腺炎等。它还可以结合并失活何种诱发症的酸性物质，能增强抗生素和其他药物的疗效等。

(2)抗病毒作用：溶菌酶的正离子特性使其可以结合带负电的病毒蛋白使其失活。

(3)增强免疫力：溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，可以改善和增强巨噬细胞的吞噬和消化能力，激活白细胞的吞噬功能，并改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少等。

(4)止血、镇痛等作用。

另外，溶菌酶作为一种无毒、无副作用的具有抗菌功能的蛋白质，可用作天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。

目前溶菌酶的纯化方法多采用结晶法。在结晶法中，对预处理的含溶菌酶的溶液，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出。这种方法操作简单，但其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂，并且此方法不能用以分离微量的溶菌酶。此外还有高效液相色谱法溶菌酶，其分离过程虽然快速简便，但是由于其仪器设备价格昂贵，所以其应用范围受到很大限制。

综上所述，目前还没有一种快速、高效的大规模纯化溶菌酶的方法，因此本领域迫切需要开发一种快速、高效的大规模化生产溶菌酶的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速、高效、大规模分离纯化溶菌酶的方法。

本发明的另一目的是提供一种适用于本发明方法的溶菌酶分离纯化装置。

在本发明的第一方面，提供了一种分离纯化溶菌酶的方法，包括步骤：

(a)将含有溶菌酶的脱脂乳清与阳离子树脂混合，从而使所述树脂吸附溶菌酶；

(b)对吸附了溶菌酶的树脂进行洗涤，从而洗去未吸附的杂蛋白；

(c)对经洗涤的所述树脂进行洗脱，从而获得含溶菌酶的洗脱液；

(d)对所述含溶菌酶的洗脱液进行超滤处理，从而获得分子量大于20kDa蛋白的组分(i)、含溶菌酶的组分(ii)和分子量小于8kDa蛋白的组分(iii)。

在另一优选例中，步骤(a)所述的含有溶菌酶的脱脂乳清是将含溶菌酶的乳汁经离心获得的。

在另一优选例中，步骤(a)所述树脂与含溶菌酶的溶液的比例为2∶8-4∶6(按体积计)，较佳地3∶7(按体积计)。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合为搅拌吸附。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合温度为低温，较佳地0-4℃。

在另一优选例中，步骤(a)所述的混合时间没有特别限制，较佳地2-12h，更佳地4-8h。

在另一优选例中，步骤(b)所述的洗涤为先用纯水洗涤，再用磷酸缓冲液洗涤，较佳地磷酸缓冲液中包含0.1mol/L NaCl，40mmol/L磷酸盐，pH为6.5。