[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测镰刀菌的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为SEQ ID NO：1～4。

2.一种利用环介导等温扩增检测镰刀菌的试剂盒，其特征是该试剂盒包括(1)-(5)的组分：

(1)环介导等温扩增反应液：10×Thermopol反应缓冲液，dATP、dGTP和dCTP各1.0～2.0mM，dTTP、dUTP各0.5～1.5mM，MgSO₄4～12mM，Betaine 0.8～1.6M，正反向内引物各1.2～1.8μM和正反向外引物各0.2～0.3μM；其中10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的Tris-HCl、100mmol/L KCl、100mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L MgSO₄和1％Triton X-100；

2)Bst DNA聚合酶，内装8U/μL的Bst DNA聚合酶；

3)UNG酶，为1U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶；

4)显色剂，内装核酸染料GeneFinder^TM；

5)阳性对照核酸，内装包含镰刀菌保守区DNA的质粒；

其中正反向内引物和正反向外引物为权利要求1所述的用于检测镰刀菌的环介导等温扩增引物。

3.权利要求2所述的试剂盒应用于水体和/或土壤中镰刀菌的检测。

4.如权利要求3所述的检测，其特征在于依次包括下列(1)-(3)步骤：

(1)待检样品或真菌DNA的提取：

利用商业化试剂盒或传统方法提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内；

(2)进行镰刀菌的环介导等温扩增反应：

A、在装有22μLLAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B、在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60-65℃扩增反应45-90min；

C、将水浴调到80-85℃终止反应，5-10min后取出待检；

(3)显色检测：

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为镰刀菌。