[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于常见病原真菌快速检测技术领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒。

背景技术

镰刀菌(Fusarium)广泛分布于自然界的土壤、水和有机物中，是一种重要的植物病原菌，可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，已知的寄主植物达100余种。镰刀菌侵染寄主植物维管束系统，会引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，严重影响作物的产量和品质，是生产上最难防治的重要病害之一。另外，镰刀菌还可感染鲈鱼等淡水鱼，引起发炎、溃烂，若不及时治疗可以发大量死亡。少数镰刀菌种也可引起人类疾病，包括浅表感染、局部感染和播散性感染途径，主要取决于患者免疫状况和感染入侵途径。对于免疫力正常患者，外伤或外来异物导致皮肤或粘膜破损是镰刀菌感染的主要途径，其中以角膜炎和甲癣最常见。在镰刀菌导致的眼科疾病中，植物性外伤是引起角膜感染的主要因素。并且镰刀菌产生蛋白酶、胶原酶及多种毒素破坏组织，常致角膜溃疡，在真菌性角膜炎中居于首位。

研究发现引发角膜炎的镰刀菌主要是茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌。对免疫缺陷人群，70％以上的镰刀菌病表现为播散性感染，最常累及皮肤，其次是肺和鼻窦。对于镰刀菌引发的感染，特别是角膜炎，若不及时治疗就有致盲的危险，所以早期的有效诊断对于指导正确的用药治疗尤为重要。

现有的镰刀菌的检测方法有病变标本真菌分离培养法、病变标本显微镜检法、血清学实验检测法、共焦显微镜观察直接观察法和PCR检测法等。其中病变标本真菌分离培养周期较长，过程繁琐，不利于快速的早期诊断；病变标本直接镜检虽然快速简单，但是阳性率不高；血清学方法对于浅表和局部感染的检测有效性较差，且不利于其他生物的检测；共焦显微镜直接观察病灶处有无镰刀菌菌丝或孢子是一种很直接的检测方法，但是共焦显微镜并不是很普及的检测仪器，限制了其推广应用。普通的PCR检测方法虽然灵敏特异，但成本较高且需要专门的PCR仪。而环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术不但具有普通PCR检测方法的灵敏特异性，还可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列；且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景，但目前尚未见用环介导等温扩增方法检测镰刀菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术检测镰刀菌的引物及试剂盒，以便快速准确的检测镰刀菌。

本发明的检测镰刀菌的环介导等温扩增引物，是根据镰刀菌18s rRNA的种间同源区域特殊设计的LAMP引物：包括可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(正向内引物和反向内引物)和两个外引物(正向外引物和反向外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链，其引物序列分别为SEQ ID NO：1～4。

正向内引物Fu-FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向内引物Fu-BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

正向外引物Fu-F3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

反向外引物Fu-B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的镰刀菌核酸等温扩增检测试剂盒包括：

1)LAMP反应液，LAMP反应液由以下组份组成：10×Thermopol反应缓冲液，dATP、dGTP和dCTP各1.0～2.0mM，dTTP、dUTP各0.5～1.5mM，MgSO₄4～12mM，Betaine 0.8～1.6M；正反向内引物各1.2～1.8μM和正反向外引物各0.2～0.3μM；

其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的Tris-HCl、100mmol/L KCl、100mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L MgSO₄和1％Triton X-100；

2)UNG酶，为1U/μL尿嘧啶DNA糖基化酶；

3)Bst DNA聚合酶，内装8U/μL的Bst DNA聚合酶；

4)显色剂，内装核酸染料GeneFinder^TM；

5)阳性对照核酸，为含镰刀菌DNA的质粒。

使用上述试剂盒检测镰刀菌，其具体方法依次包括下列步骤(1)-(3)：