[发明专利]一种T载体及其构建方法与其前T载体

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及生物工程技术领域，涉及一种基因工程操作中的DNA片段克隆方法。具体地，本发明涉及一种T载体及其构建方法与其前T载体。

背景技术

DNA的重组技术，也就是基因克隆技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。广义来说，DNA的重组技术是指利用供体生物的遗传物质，或人工合成的DNA分子，经过体外的分离纯化、PCR扩增、限制酶切割等处理后与适当的载体连接起来形成新的重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入受体生物中，从而实现对目标DNA分子的保存、扩增和分析等操作。

可以作为DNA载体的有质粒、粘粒、噬菌体、人工染色体等，其中质粒载体是应用最为广泛的分子克隆载体。一个完整的基因工程质粒载体包括复制子(用于控制质粒分子在宿主体内的复制与扩增)、筛选基因(如抗性基因、报告基因，或两者都有，用于确认、跟踪或分离带目标质粒的宿主)、多克隆位点(便于DNA分子的切割与连接)以及用于控制质粒行为(如拷贝数)或用于分析的一些特别的DNA序列(如用于质粒测序的一些引物互补序列等)。

DNA分子的切割与连接可以通过限制性内切酶和连接酶来完成，即分别用相应的限制性内切酶切割目标DNA分子和载体DNA分子，使其两端分别获得含有部分单链突出的末端(粘性末端)，含有互补序列的末端(由同一个酶或同尾酶切割获得)在DNA连接酶的作用下形成一条完整的DNA链。

PCR技术的产生与发展使得利用PCR技术获得待克隆的DNA分子成为一种方便而高效的手段，但对于利用PCR方法获得的片段而言，采用限制酶切割的方法获得与载体匹配的末端有诸多不便：首先，需要在PCR产物两端引入相应的酶切位点，增加了引物的成本；其次，当限制性内切酶识别位点位于DNA片段的末端时，其切割效率受影响；再次，用限制性内切酶处理后，正确切割或未切割的DNA分子难以分离，这将影响后续DNA片段与载体的连接效率。因此，一种针对PCR片段的克隆技术——TA克隆——得到发展并被广泛使用。

TA克隆技术是指把PCR片段与一个具有单个3’-dT突出的载体DNA分子连接起来的方法。其原理在于，在PCR反应中所使用的如Taq等DNA聚合酶具有末端转移的活性，该活性使得其能在PCR扩增得到的DNA分子末端的3’端添加一个突出的dA，从而可以与具有3’-dT突出的载体DNA分子互补连接。与限制性内切酶切割后连接的方法相比，TA克隆使得通过PCR获得的DNA片段可以直接克隆到载体中，大大简化了克隆过程，提高了效率。经过特别设计和加工制备的两端具有3’-dT突出的线性DNA载体则称为T载体。

T载体是TA克隆技术的核心，目前常用的T载体制备方法有两种：一种是平末端添T法，即在环状的质粒载体(T载体前体)预设位置处用合适的限制性内切酶(如EcoR V，Sma I等)切割，形成两端为平末端的线性DNA分子，随后用带有末端转移酶活性的酶在合适的条件下在线性DNA分子的两端添加一个3’-dT，经过进一步纯化，获得制备好的T载体；

另一种制备T载体的方法是酶切法，该方法利用某些限制性内切酶(如Xcm I，Eam1 105 I等)切割后在3’留下单个核苷酸的特性，经过精心设计，使得该位置的核苷酸为T，因此，在载体上设计两个串联的该酶的识别位点，则切割后在载体的两端分别获得一个突出的3’-dT，回收该线性DNA分子即为T载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种T载体及其构建方法与其前T载体。

本发明首先公开了一种T载体，为两个末端均带有3’-dT突出的线性载体，所述两个3’-dT突出末端的旁侧序列满足当经所述T载体与两端带3’-dA的PCR产物相连后，在插入片段两端能形成两个限制性内切酶酶切位点；所述两个限制性内切酶酶切位点为同一种限制性内切酶的酶切位点。

所述限制性内切酶酶切位点可以是，但不局限于Hind III酶切位点。

所述T载体中还应当带有其他T载体常用的必须元件。

所述T载体常用的必须元件包括：复制子、抗性基因(如氨苄青霉素基因表达盒)和筛选标记(如lacZ’标记基因等)。T载体中还可选择性地包括下列元件：用于控制质粒行为(如拷贝数)或用于分析的一些特别的DNA序列等。

较佳的，所述T载体与两端带3’-dA的PCR产物相连后，除PCR产物自带的限制性内切酶酶切位点外，仅含有两个限制性内切酶识别位点。T载体中没有其他常用的限制性内切酶识别位点，可以用通用引物进行DNA序列测定。