[发明专利]KIT信号相关基因QPCR芯片

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于KIT信号相关基因检测的QPCR芯片。

背景技术

人KIT原癌基因起源于HZ4猫肉瘤病毒，位于人染色体4q12，在4号染色体长臂中心体周围区域，是白色斑点显性基因的等位基因。在小鼠中该基因位于第5号染色体距着丝粒约42cM处。人类KIT基因组DNA全长大约89kb，包括21个外显子。KIT基因编码的蛋白质被称为KIT或c-kit受体，是一个分子量为145kD的I型跨膜性糖蛋白，属于III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员，分布于细胞膜表面。其结构类似于巨噬细胞集落刺激因子和血小板源生长因子受体，由胞外结构域、单一跨膜区及胞内酪氨酸激酶区域三部分组成。胞外区包含5个免疫球蛋白样结构域，开始的3个是SCF(干细胞因子)结合区，第4、5个结构域在稳定SCF及诱导KIT受体二聚化方面起重要作用。Broudy等研究发现第5个结构域还与KIT受体从细胞膜上的溶蛋白性裂解有关。胞内部分则包含了由ATP结合区和磷酸转移酶区组成的具有酪氨酸激酶活性的结构域。其配体为肥大细胞生长因子、干细胞生长因子、steel因子等，以分泌型和膜结合型两种方式与KIT受体结合。分泌型可使KIT受体激活、内化、降解；膜结合型则能维持KIT受体较长的激活状态。KIT受体与配体特异性结合可触发其同源二聚化和细胞膜内酪氨酸残基的磷酸化，产生停泊位点，捕获含SH2结构域的信号分子，还能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Racl、JNK、Raf-1、JAK2等，通过多种信号因子的参与将细胞外的信号转导到细胞内部，引发某些基因的特异性表达。SCF/KIT共同参与多种细胞信号的转导，如：Jak/STAT信号途径、PI3K途径、Src家族激酶途径、Ras/Raf/MEK/ERK信号途径等，是各种底物激酶的酪氨酸磷酸化和丝/苏氨酸激酶磷酸化的整合步骤，并且存在着多种信号转导途径之间的交互作用(cross-talking)，从而精确地调控细胞的增殖和分化。Kit基因突变不仅仅影响黑素细胞的迁徙与分化而导致斑驳病的产生，也会影响原始生殖细胞的发育而导致不孕不育，以及影响造血细胞生成而导致贫血及肥大细胞缺乏等，严重的Kit基因突变还会导致纯合致死，同时，Kit基因是一个重要的原癌基因，Kit基因高表达会导致粒细胞白血病、精原细胞瘤及消化系统间质肿瘤。SCF/KIT共同参与的多种细胞信号转导与上述病变密切相关，这些疾病病理发育过程中相关信号过程的变化是近年来kit信号转导研究中的热点问题。

QPCR(Real-Time Quantitative PCR)在基因表达水平、病原体及产前诊断等方面得到广泛运用。其原理是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，常用的两种方法为SYBR Green(荧光染料掺入法)和Taqman probe(探针法)。SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(melting curve)分析的软件加以解决。相关论文最早发表于1996年，随后在实验方法、仪器设备上进行了一系列改善，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。近年来，对于荧光定量PCR的要求越来越规范化。从RNA的提取→RNA完整性和纯度的鉴定→逆转录→反应体系的优化→最后的数据分析都有一套严格的标准，从而增加了荧光定量PCR结果的可靠程度，也使实验的可重复性得到提高。QPCR芯片是在仪器设备更新的基础上发展起来的，将近百个或数百个QPCR反应设计在一块板子上同时进行扩增，以检测相关基因的表达丰度。

基因芯片是“高通量”现代生物技术的标志，其原理是基于核酸分子杂交，用荧光染料标记样本DNA或cDNA，与基因芯片杂交，经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交信号，通过计算机处理、分析，得到所需信息。突出特点在于高通量、微型化和自动化。但它存在三个方面的缺点：1、费用高；2、难以检测低丰度表达的基因；3、偏重高通量(一次检测上万个甚至几万个基因)，缺少针对如皮肤、海马组织或某种肿瘤等特定组织类型的表达“芯片”。