[发明专利]家蚕蛹期特异的BmCP283基因启动子及其制备方法与运用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，特别涉及家蚕BmCP283基因启动子及其运用。

背景技术

家蚕属于全变态昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹和成虫4个形态特征和生理功能显著不同的发育阶段。从幼虫吐丝完毕至成虫羽化的阶段被称为变态期，包含幼虫-蛹和蛹-蛾的变态。作为重要的经济昆虫，家蚕在生产上主要用于结茧缫丝。家蚕在幼虫末期熟蚕时开始上蔟吐丝，经过3日左右吐丝终了，再经过1～2日蜕皮化蛹，经两周左右羽化成蛾，交配产卵。生产上必须在幼虫化蛹后且化蛾前完成鲜茧的收购，然后利用热能或其他方法烘死蚕蛹和寄生蝇蛆，防止出蛾、出蛆、霉变，并除去蛹体及茧层的自由水分以达到长期安全贮藏的目的。由于时间紧迫，而且要保证蚕茧收购、运输和烘干的顺利进行，给生产造成了一定难度。又由于茧丝成分主要是蛋白质，高温烘烤使蚕丝品质受到破坏，影响后加工。因此，如果能通过遗传改良等方法使蛹期发育延长或停滞，这将有助于解决鲜茧收烘与蛹发育过短之间的矛盾，改革蚕茧收购-烘干-缫丝的传统生产模式，促使生丝加工工艺的重大改革并显著提高生丝品质。

在遗传上实现家蚕蛹期发育调控主要涉及两个关键问题，一是有用于使蛹期发育延长或停滞的靶基因，该基因的转录沉默或超量表达能对蛹期发育进行有效的控制；二是使候选靶基因在蛹期（化蛾前）特异表达，如果在胚胎、幼虫或成虫等其他发育阶段发挥作用，势必达不到预期效果，甚至会影响正常的蚕茧产量。因此，蛹期特异的启动子是实现该目标的重要保证，但至今相关研究较少。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子为家蚕蛹期特异性启动子。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

家蚕BmCP283基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

家蚕BmCP283基因启动子的截短片段，所述截短片段为如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明的目的之二在于提供一种启动子得制备方法，该方法操作简单，适用于普通实验室使用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmCP283基因启动子的制备方法，具体步骤为：以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示；

扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，59.9℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟，得如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子。

本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，其能对蛹期发育进行有效的控制。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕BmCP283基因启动子的重组载体。

进一步，所述重组载体为BmCP283-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[BmCP283-DsRed-SV40, 3xP3EGFP] 的重组载体；

本发明的目的之四在于提供一种所述重组载体的制备方法，该方法适用于普通实验室。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的重组载体的制备方法，将经酶切的如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与经同样酶切的含有具备表达外源蛋白的基因的载体片段连接，得显微注射载体。

进一步，酶切所述显微注射载体后与经同样酶切的含有荧光蛋白标签的基础载体连接，得含有荧光蛋白标签的显微注射载体；

进一步，将如SEQ ID NO:1所示的家蚕BmCP283基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组载体，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切pMD19- BmCP283质粒，回收家蚕BmCP283基因启动子与分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pSL[ser1-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[BmCP283-DsRed-SV40]；

进一步，用AscⅠ酶切步骤B所得pSL[BmCP283-DsRed-SV40]，将酶切所获得的BmBmCP283-DsRed-SV40片段连接到AscⅠ酶切的pBac[3xP3-EGFPafm]基础载体，构建成pBac[BmCP283-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。