[发明专利]细胞转核诱导体细胞成多能二倍体干细胞的方法

说明书

本申请是申请号为200680046641.4(国际申请日为2006年10月16日、国际申请号为PCT/US2006/040723，优先权文件：2005年10月14日申请的US20050726915P、2006年2月21日申请的US20060358465)、发明名称为“体内和体外再生细胞的方法”的进入国家阶段的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及再生细胞的方法以及这些被再生细胞的人类临床和兽医的应用，更具体地说，涉及通过细胞转核诱导体细胞成多能二倍体干细胞的方法。所述的再生方法还适用于哺乳动物的器官和身体。

背景技术

老化是生命不可避免的过程。老化是一种有害的、进行性、普遍性且因而不可逆的变化综合症。细胞的老化特征在于减少细胞的功能、降低对应激响应的能力、增加了体内稳态的失衡以及增加了患疾病的风险。因此，老化本身可被视作“疾病过程”，并且是对大分子、细胞、组织和器官损伤的积聚。

细胞的老化由运行于个体寿命始终的生物钟调节，依赖于影响负责维护、修复和防御响应的系统的基因表达的变化。老化与在DNA复制过程中细胞分裂期间的端粒变短相关。老化是由累积突变和损伤而加速的，从大分子(DNA，RNA，蛋白质，碳水化合物和脂质)到组织，通过自由基、糖化、辐射、交联剂等而引起的。

目前已确定了在老化过程中的多种基因途径。这些途径的其中一种涉及基因Sir2，一种NAD+-依赖性组蛋白脱乙酰基酶。额外拷贝的Sir2能够延长蠕虫和蝇类的寿命。人类似物SIRT1蛋白已被证实为脱乙酰p53、Ku70、特异性组蛋白残基和叉头家族的转录因子。超氧化物歧化酶，一种防止线粒体自由基作用的蛋白质，当它被过量表达时可以延长稳定期酵母的寿命。但是，尚未清楚这些机理是否也存在于人类中，因为在人类和模型有机体之间在生物学和病理生理学方面存在明显的区别。

通常，生命的质量随老化而下降。因为老化，腱和韧带中的胶原蛋白和弹性蛋白变得弹性更小和更片断化，特别是由于糖化(由糖交联蛋白质)。关节软骨变得已磨损，而且接头间关节液变得“更稀薄”。在循化功能方面的衰退有助于这个过程。胶原蛋白和弹性蛋白还在皮肤中交联，导致弹性的损失。手指甲中角质蛋白还是皮肤外层(表皮)的成分，其提供了“防水性”。表皮随年龄而变薄，导致皱褶。汗腺分泌的减少增加了热休克易发性。当与毛囊相关的黑色素细胞(产生皮肤和毛发着色物质黑色素的细胞)失去功能时，毛发变白。黑色素细胞功能的部分减少导致毛发变灰。然而，90％白种人表现为黑色素增加，在他们手背上呈现棕色斑点的形式(“肝斑”)。肺部胶原蛋白和弹性蛋白的韧性损失导致弹性反冲更小。排气变得更加困难，这减少了空气交换和呼吸，并因此降低了工作能力。

动物细胞可分为生殖细胞(精子或卵)、干细胞以及体细胞(已分化的功能性体细胞)。在组织培养中的胚胎纤维原细胞在他们达到50次分裂的Hayflick限度之前中止分裂(Hayflick L，Moorhead PS Exp Cell Res 1961，25：585-621)。生殖细胞、干细胞和“永生化”癌细胞包含一种被称作端粒酶的酶，其代替了损失的端粒，因此使它们不经历Hayflick限度。在人的生殖细胞和大约85％的癌细胞中，这种酶-人端粒酶逆转录酶(hTERT)和RNA模板足以产生新的端粒。维持端粒功能所需蛋白质中的缺陷还可导致染色体的不稳定性和癌症。端粒酶表达还使细胞对氧化性应激所诱导的凋亡产生更大的抗性。

已用端粒酶的逆转录酶亚基转染的人体细胞表达端粒酶。这种细胞显示超出它们Hayflick限度的20群体倍增，并且继续显示为常规的、健康的和年轻的细胞外观及活性。这种结果创造了一个现实的期望，采用一种形式的基因治疗，在体细胞中诱导自体端粒酶的表达或者在自然形成之前将遗传物质添加至工程化端粒酶组成的细胞中，在一些组织中保存青春是可能的。

关于通过生活方式改变和预防性疾病的预防(例如，减少热量的摄入同时维持适当的营养、食用低脂肪/高纤维的饮食、避免烟草和酒精、锻炼、以及接受抗氧化剂补充剂)而减缓老化进程以延长平均寿命，已进行了广泛的研究。但是，没有极端的生活方式改变，难于取得减缓老化的非常直接的益处。