[发明专利]一种高纯度棘白菌素B的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高纯度棘白菌素B的制备方法。

背景技术

棘白菌素类是近年来新上市的一种抗真菌药物。棘白菌素类药作为新一代全身性抗真菌药，不经过肝代谢和肾清除，使联合用药以及肝、肾功能不良患者无需调整剂量成为可能。它们能够抑制真菌细胞中1，3-β-D葡聚糖的合成，具有毒性低和良好的动力学性质。其独特的作用靶点和确切显著的疗效，必将使其很快替代三唑类药成为医生和患者抗真菌药物的首选。

目前进入临床研究的此类药物有三种：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。阿尼芬净是第三代棘白菌素类的半合成抗真菌药，对治疗念珠菌和霉曲菌引起的严重感染具有广阔的前景。2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证，用于治疗食管感染和其他形式的念珠菌感染。

阿尼芬净以发酵产物棘白菌素B(EchinocandinB)为原料，经犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)产生的酰化酶作用脱去侧链亚油酰基，然后在DMF中与活性中间体4”-戊氧基-[1，1’，4’，1”]三苯基-4-甲酸-2，4，5-三氯-苯基酯反应制得。

Echinocandin B是曲霉菌属(Aspergillus sp.)的发酵代谢产物，结构式如下：

目前，关于棘白菌素类药物提取分离的文献报道很少，且已有的制备方法具有工艺复杂，所得产品纯度不高、收率低等诸多缺点，难于实现规模化生产。辉瑞公司的科研人员对其进行过系统研究，但在分离纯化工艺方面仅仅是实验室工艺的研究，尚没有成熟的能够直接应用于规模化生产的方法介绍。中国专利CN101659692A描述了Echinocandin B分离提取工艺的研究，该方法采取两种溶剂反复浓缩萃取，再借助树脂柱分离纯化Echinocandin B。其不足之处在于整个工艺须经三步填料柱纯化，工艺过于繁琐，难以放大；用酸性氧化铝对提取液进行脱色处理，成本较高；且整个工艺过程溶媒使用量较大、收率偏低，不利于工业化规模生产。

发明内容

本发明的目的在于开发一种操作简便，所用溶剂毒性低，适于工业化生产Echinocandin B的方法。本发明采用大孔吸附树脂提取分离Echinocandin B，工艺简单易行，适宜于工业化生产；并首次将Fraclite800树脂用于Echinocandin B的层析分离，可以制备高纯度的Echinocandin B产品。

下面对本发明进行具体描述：

在本发明方法中，通过固液分离去除杂质含量高的滤液，得到EchinocandinB发酵培养物。在发酵培养物中加入乙醇溶解Echinocandin B，收集乙醇提取液，并调低浓度后导入大孔吸附树脂进行富集，极性较大的杂质和小分子蛋白由于不被吸附而流出。饱和树脂用低浓度的乙醇净化洗涤后，用解吸剂解吸，收集的解吸液中加入活性炭脱色。脱色液经浓缩、萃取、结晶，得到Echinocandin B粗提物。粗提物经Fraclite800树脂层析分离，得到高纯度的Echinocandin B产品。

具体地，本发明涉及一种高纯度Echinocandin B的制备方法，包括下述步骤：

1)棘白菌素B发酵液固液分离，得到固形发酵培养物；

2)在固形发酵培养物中加入极性溶剂浸泡；

3)浸泡液固液分离，得到棘白菌素B提取液；

4)将调低极性溶剂浓度的提取液导入大孔吸附树脂进行富集；

5)吸附完毕，用梯度极性溶剂洗涤树脂，然后用解吸剂进行解吸；

6)解吸液脱色，搅拌均匀后过滤；

7)脱色液浓缩、萃取、结晶得棘白菌素B粗提物；

8)粗提物经Fraclite800层析分离，得到高纯度的棘白菌素B产品。

其中，步骤1)中的发酵培养物为通过传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到干燥的Echinocandin B发酵培养物。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质存在于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。

步骤2)中向固形发酵培养物中加入极性溶剂乙醇或甲醇，加入的量为每千克固形发酵培养物2-6升，优选为4-6升。极性溶剂的浓度为70-90％，优选为70-80％。