[发明专利]一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法

权利要求书

1.一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，其特征在于含有pIRES质粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，

T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上；

所述T-bet基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HBV-L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述复合型治疗性乙肝基因疫苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)RT-PCR法克隆人T-bet基因，人T-bet基因与pMD18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/T-bet，然后用Nhe I、EcoR I从pMD18-T/T-bet载体上切下T-bet目的片段基因，与载体pIRES连接构建pIRES/T-bet。

(2)以pCDNA3.1(-)/HBV-L为模板PCR扩增出HBV-L基因，HBV-L基因与pMD 18-T Simple Vector进行连接，构建一个亚克隆载体pMD18-T/HBV-L，然后用Sal I、Not I从pMD18-T/HBV-L载体上切下HBV-L基因片段，与构建完成的pIRES/T-bet连接，得到复合型治疗性乙肝基因疫苗。

3.权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取健康人外周血单个核细胞的RNA通过逆转录合成cDNA；将得到的cDNA为模板，通过引物P1和P2进行PCR扩增，得到长度为1608bp的T-bet片段；

所述的引物P1：5’-ATAATGGGCATCGTGGAGC-3’；

所述的引物P2：5’-CCGCCGTTCAGTTGGGA AAATAG-3’；

斜体下划线所述的GCTAGC为Nhe I酶切位点；

斜体下划线所述的GAATTC为EcoR I酶切位点；

(2)以质粒pCDNA3.1(-)/HBV-L(北京地坛医院成军教授惠赠)为模板，通过引物P3和P4进行PCR扩增，得到长度为1203bp的HBV-L基因片段；

所述的引物P3：5’-GCAGCATGGGAGGTTGGTCTT-3’；

所述的引物P4：5’-TTAAGATGAGCTCGGATTCTCAAATG-3’；

斜体下划线所述的GTCGAC为Sal I酶切位点；

斜体下划线所述的GCGGCCGC为Not I酶切位点。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所诉PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min 30sec，94℃ 45sec，51℃ 30sec，72℃ 2min，共35个循环，72℃再延伸10min；并且向反应体系中加入5％体积的DMSO。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所诉PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min 30sec，94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环，72℃再延伸10min。

6.权利要求1所述复合型治疗性乙肝基因疫苗的用途，其特征在于：用于预防和治疗乙型病毒型肝炎或其它病毒性疾病。