[发明专利]一种复合型治疗性乙肝基因疫苗及其构建方法

说明书

所属技术领域：

本发明涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，同时本发明也涉及这种疫苗的构建方法。

背景技术：

据统计，全球已有20多亿人经历HBV感染。疫苗接种是控制和预防乙型肝炎及其长期严重后遗症最有效的措施。自1997年世界卫生组织(WHO)推荐实施乙肝疫苗计划免疫以来，大范围的疫苗接种有效降低了HBV感染率，然而HBV持续感染者仍超过3.7亿，每年甚至有100多万患者死于急性或慢性HBV感染导致的肝硬化、肝功能衰竭和原发性肝细胞癌。预防和治疗HBV感染迫在眉睫。

目前，治疗乙型肝炎感染者两个难以解决的难题：①肝内HBV长期存在并有不同程度复制，现有的抗病毒药物难以根除HBV；②绝大部分病人对HBV及其抗原呈免疫耐受状态，使肝内HBV免受免疫杀伤，从而有利于病毒在肝内持续存在并复制。

治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗显著不同。预防性疫苗主要诱导机体产生体液免疫反应，而对病毒性疾病的研究发现，体液免疫并不能彻底清除细胞内感染病毒，只有细胞介导免疫反应，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫反应才能发挥最根本的作用。进一步的研究表明细胞免疫所产生的CTL将在清除被感染细胞的过程中起到十分重要的作用。

DNA疫苗作为20世纪90年代出现的一种新型治疗性疫苗，是一种含抗原基因的表达质粒，能全面地诱导特异性体液和细胞免疫应答。HBV DNA疫苗更是能打破其对HBsAg的免疫耐受，激发特异性CTL反应，有效地清除HBV，中止感染。

Davis HL等研究证实，对小鼠和黑猩猩免疫接种PCMV-S2-S疫苗都能诱导产生抗-HBs、抗pre-S2抗体，还能产生对HBsAg的细胞免疫应答。Masanori Isogawa等研究表明，用表达HBsAg抗原的质粒DNA直接免疫小鼠，可有效诱导特异性血清抗体产生以及MHC I类限制性CTL应答，且该CTL应答在体内是由CD4⁺、CD8⁺效应细胞介导的。

HBV DNA疫苗在注射部位被原位细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节相应靶蛋白的合成。靶蛋白被分解为肽段，肽段表位与β2微球蛋白和主要组织相容性复合体(MHC)I类分子形成三聚体.递呈并激活CD8⁺T效应细胞；或靶蛋白通过血运和(或)淋巴循环系统汇集于淋巴结或脾脏中，为“专业”抗原递呈细胞(APC)所吞噬，经与MHC II类分子结合.激活CD4⁺和Th细胞，Th细胞激活B效应细胞(Be)和B记忆细胞(Bm)，Be将在骨髓中形成生发中心，长期生成特异性抗体，Bm可诱导T记忆细胞(Tm)的产生，而Tm则作为潜在的CTL，保存在循环库中。由于DNA疫苗表达的蛋白质可作为内源性抗原被递呈，故具有传统疫苗所不具备的优势，即能够有效地诱导机体CTL的细胞免疫应答。

研究表明，DNA疫苗诱生的CTL可识别和溶解体内感染HBV的细胞，特别是此种CTL可分泌IFN-γ，并可抑制感染细胞内的病毒复制或清除病毒而不引发细胞损伤。此外.HBV DNA疫苗因可启动有效的抗原提呈途径.促进机体合成内源性抗原，提呈相关表位。大量产生CD8⁺CTL细胞，所以这类疫苗也可以作为治疗慢性乙型肝炎患者的候选物。

T-bet，也称Tbx21，系2000年哈佛大学Szabo等发现的一种重要的Th1细胞转录因子，为T-box家族的新成员，是IFN-γ基因强有力的转录激活剂，又能诱导并保持IL-12Rβ2的表达，且能将分化中的效应性Th2和已完全分化的Th2逆转为Th1，伴随产生大量的IFN-γ，并抑制IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的产生，从而影响机体的免疫应答。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可在pIRES中共表达乙肝表面抗原大蛋白HBV-L和免疫佐剂T-bet蛋白的基因疫苗及其构建方法。

本发明采用的技术方案为：一种复合型治疗性乙肝基因疫苗，含有pIRES质粒，T-bet基因和HBV-L基因，其中T-bet基因和HBV-L基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件的两侧；其中，pIRES为商业性的质粒，含有多克隆位点A(MCSA)，多克隆位点B(MCSB)和IRES元件，MCSA和MCSB分别位于IRES元件的两侧，T-bet基因位于MCSA上，HBV-L基因位于MCSB上。

所述复合型治疗性乙肝基因疫苗构建方法包括以下步骤：