[发明专利]表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌、其构建方法及应用

权利要求书

1.表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)SMD1168工程菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5046。

2.构建权利要求1所述的重组酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)Gp90基因的扩增

以禽网状内皮组织增生病病毒REV/HLJR0901的基因组为模板，GenBank登录号为GQ415646，设计特异性扩增引物，扩增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO：1所示；所述的HLJR0901株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5015；

(2)将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建成重组质粒pPIC9k-Gp90，电转化巴斯德毕赤酵母SMD1168感受态细胞，抗生素筛选，PCR鉴定，得到重组酵母菌株；

(3)对重组酵母菌株进行诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株，即得。

3.权利要求1所述的重组酵母工程菌株在表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白中的应用。

4.由权利要求1所述的重组酵母基因工程菌株表达的禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白。

5.权利要求4所述的重组蛋白在制备预防禽网状内皮组织增生病疫苗药物中的应用。

6.一种预防禽网状内皮组织增生病的重组抗原疫苗，其特征在于包含有效剂量的权利要求4所述的重组蛋白和药学上可接受的载体。

7.权利要求6所述的重组抗原疫苗在制备预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。

8.一种使用权利要求1所述的重组酵母工程菌株发酵的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取权利要求1所述的重组酵母工程菌株1ml接种于50ml MGY培养基中，30℃300rpm培养至OD₆₀₀为2-6时，接入发酵罐中，用基础盐培养基进行发酵培养；

(2)转速级联到溶氧控制上，维持溶氧40％，温度30℃，pH 6.0，培养20-24h，待溶氧升高，转速下降时补加50％甘油，补加速度为15ml/L·h，补加4个小时，随后进入甲醇诱导期，开始甲醇补量为3.5ml/L·h，此阶段持续2～5h，随后根据发酵情况适度增加甲醇补量；

(3)发酵72小时后收获上清，进行SDS-PAGE和Western blot分析，并进行蛋白浓度测定。

9.如权利要求8所述的重组酵母工程菌株发酵的方法，其特征在于所述的基础盐培养基按照以下方法配制：26.7mL 85％H₃PO4，0.93g CaSO4·2H₂O，18.2g K₂SO₄，14.9g MgSO₄·7H2O，4.13g KOH，40g甘油溶解于去离子水中，定容至1L；高压灭菌后，pH为1～1.5，温度降到30℃后，用30％NH₄OH调pH至5.0。