[发明专利]表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程技术构建的重组酵母基因工程菌株，特别涉及一种表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌，还涉及其构建方法，进一步涉及所表达的重组蛋白及其在研制新型抗禽网状内皮组织增生病病毒的重组抗原疫苗中的应用。本发明属于生物医药领域。 

背景技术

禽网状内皮组织增生病是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)感染引起的，能够导致鸡体免疫抑制的一种重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。随着该病近年来呈现的新的变化，如发病日龄升高，感染发病后死亡率升高，混合感染和继发感染严重等，使得对该病的防治越来越棘手，但传统疫苗生产难度大，病毒弱化困难，而且致弱的病毒很容易返强，使其很难在生产中安全应用。 

REV基因组编码Gag、Pol和Env三种蛋白，囊膜蛋白env进一步分为Gp90和Gp20两种蛋白，其中Gp90蛋白在病毒刺激机体产生中和抗体方面具有重要作用，人们利用大肠杆菌原核表达系统及杆状病毒等真核表达系统对Gp90基因均进行了体外表达，但是由于表达产物或者不能刺激机体产生中和抗体，或者蛋白表达量低，要产生高滴度抗体需要多次加强免疫，因此，从经济的角度考虑，不适合用于大规模商业化生产。 

本项目所利用的甲醇酵母具有表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉等特点，使得利用该系统开发禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗具有很好应用前景。本申请所应用的疫苗具有上述价廉，生物活性好等优点，能够为防制当前流行的禽网状内皮组织增生病提供确实、有效的工具和手段，并可为防制禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。由于新型疫苗相对于传统疫苗具有更低的成本，这将为该疫苗的应用创造了一个很好的条件，投入应用后既能有 效的防止疫病造成的损失，同时也降低了养殖成本。该疫苗的研制将创造更大的经济效益和社会效益。 

发明内容

针对上述问题，本发明所解决的第一个技术问题是提供一种表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90蛋白的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)SMD1168工程菌株，该菌株(pPIC9KrREVgp90/SMD1168)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5046，保藏日期为2011年7月8日； 

本发明所解决的第二个技术问题是提供一种构建以上所述的重组酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步骤： 

(1)Gp90基因的扩增 

以禽网状内皮组织增生病病毒REV/HLJR0901的基因组为模板，GenBank登录号为GQ415646，设计特异性扩增引物，扩增出Gp90基因序列，如SEQ IDNO：1所示；所述的HLJR0901株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5015，保藏日期为2011年7月8日； 

(2)将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建成重组质粒pPIC9k-Gp90，电转化酵母SMD1168感受态细胞，抗生素筛选，PCR鉴定，得到重组酵母菌株； 

(3)对重组酵母菌株进行诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株，即得。 

其中所述的引物序列可为： 

Gp90F：5’AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC 3’ 

Gp90R：5’AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3’ 

本发明所解决的第三个技术问题是提供所述的重组酵母工程菌株在表达禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白中的应用。 

本发明所解决的第四个技术问题是提供一种由所述的重组酵母基因工程菌株表达的禽网状内皮组织增生病病毒Gp90重组蛋白；及所述的重组蛋白在制备预防禽网状内皮组织增生病疫苗药物中的应用。 

本发明所解决的第五个技术问题是提供一种预防禽网状内皮组织增生病的重组抗原疫苗，其特征在于包含有效剂量的本发明所述的重组酵母基因工程菌株表达的重组蛋白和药学上可接受的载体以及所述的重组抗原疫苗在制备预防禽网状内皮组织增生病药物中的应用。 

本发明所解决的第六个技术问题是提供了一种使用本发明所述的重组酵母菌株进行发酵的方法，其特征在于包括以下步骤：