[发明专利]从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法

权利要求书

1.从刮宫样品中获取人宫内膜间充质干细胞的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、样品收集：

将人流产物与采集液按照1∶0.9～1.1的体积比混合；得刮宫样品；

所述采集液为：在每500mL的采集液中含有400单位肝素以及浓度为4mg/mL的环丙沙星和浓度为10mg/mL的卡那霉素，其余为DMEM培养基；

2)、宫内膜干细胞分离培养：

A、样本的初处理：

将刮宫样品于3～5℃进行摇床孵育22～26小时，然后进行过滤；得滤液；

B、利用密度梯度离心法，收集血液中的碎片组织及单核细胞，依次进行以下步骤：

滤液1500～2500g离心8～12分钟，分别得位于上层的上清和位于下层的血液；

取部分上清用于病毒检测，如病毒检测为阳性，则结束整个操作；如病毒检测为阴性，则继续进行以下操作：

用PBS缓冲液稀释血液，所述PBS缓冲液与血液的体积用量比为1.5～2.5∶1；

将稀释后的血液加至人淋巴细胞分离液上，所述稀释后的血液和人淋巴细胞分离液的体积比为1.8～2.2∶1，600～1000g离心12～18分钟，离心完毕后，离心管内出现明显的分层；吸出位于中间的单核细胞层，用PBS缓冲液洗涤细胞后离心，最后用Chang完全培养基制成单细胞悬液；

C、细胞的培养：

将上述步骤所得的单细胞悬液接种于Chang完全培养基中，细胞接种密度为1×10⁵～1×10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养；培养时间为4～5天；

所述Chang完全培养基由以下成分组成：65ml的MEM alpha培养基、18ml的Chang B、2ml的Chang C、1ml的Penicillin/Streptomycin、1ml的浓度为200mM的L-glutamine和15ml的ES-FBS；

D、细胞扩增和纯化：

待步骤3)的4～5天的培养结束后，更换培养基，弃除未贴壁细胞；每3～4天全量换液一次，待细胞生长达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000～6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；

上述过程在37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行；

3)、细胞冻存：

待上述步骤所得的P1代细胞铺满瓶底后，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，用预冷的冻存液重悬细胞，得细胞悬液，所述细胞悬液中细胞的浓度是1-2*10⁶/ml；所述冻存液为DMSO与Chang完全培养基按照1∶9的体积比混合而得；

将上述细胞悬液进行如下冻存程序：

第一步、4℃，等待；

第二步、1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步、10.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步、1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步、10.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步结束；得冻存样本；

将所述冻存样本放入液氮储存罐保存。