[发明专利]拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及拟穴青蟹抗菌肽的基因工程表达，特别涉及拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的毕赤酵母表达及其制备方法。

背景技术

拟穴青蟹[Scylla paramamosain(Estampador，1949)]，俗称青蟹，隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属(Scylla)，是我国东南沿海最重要的海洋经济蟹类之一。随着青蟹养殖规模地不断扩大，由细菌、真菌、病毒和寄生虫等因素引起的疾病对蟹类养殖业造成巨大损失。

抗菌肽被认为是鱼虾蟹贝等防御系统的主要成分之一，是生物体先天免疫系统的重要组成分。已预见到抗菌肽在海水养殖鱼类、蟹类、贝类等的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗耐药性细菌药物和饲料免疫添加剂。研究、开发与应用抗菌肽，对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和鱼类饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值，并且将会取得显著的经济效益。

自1996年，第一个6.5kDa的富含脯氨酸的蟹类抗菌肽从岸蟹(Carcinus maenas)中分离，到目前为止已经在蟹类发现了多种抗菌肽，如Callinectin，抗脂多糖因子(ALF)([5]Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakajon A，Sittipraneed S.Antilipopolysaccharide factor(ALF)of mud crab Scylla paramamosain：molecular cloning，genomic organization and the antimicrobial activity of its synthetic LPS binding domain[J].Mol Immunol.，2007，44(12)：3195-3203；[6]Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakaj on A.Molecular cloning，genomic organization and antibacterial activity of a second isoform of antilipopolysaccharide factor(ALF)from the mud crab，Scylla paramamosain[J].Fish Shellfish Immunol.，2011，30(1)：58-66)，Crustin([7]Brockton V，Smith V J.Crustin expression following bacterial injection and temperature change in the shore crab，Carcinus maenas[J].Dev Comp Immunol.，2008，32(9)：1027-1033；[8]Sperstad S V，Haug T，Paulsen V，Rode T M，Strandskog G，Solem S T，Styrvold O B，K.Characterization of crustins from the hemocytes of the spider crab，Hyas araneus，and the red king crab，Paralithodes camtschaticus[J].Dev Comp Immunol.，2009，33(4)：583-591；[9]Mu C，Zheng P，Zhao J，Wang L，Zhang H，Qiu L，Gai Y，Song L.Molecular characterization and expression of a crustin-like gene from Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J].Dev Comp Immunol.，2010，34(7)：734-740)，Scygonadin([10]Huang W S，Wang K J，Yang M，Cai J J，Li S J，Wang G Z.Purification and part characterization of a novel antibacterial protein Scygonadin，isolated from the seminal plasma of mud crab Scylla serrata(，1775)[J].Exp.Mar.Biol.Ecol.，2006，339：37-42；[11]Wang K J，Huang W S，Yang M，Chen H Y，Bo J，Li S J，Wang G Z，A male-specific expression gene，encodes a novel anionic antimicrobial peptide，scygonadin，in Scylla serrata[J].Mol.Immunol.，2007，44：1961-1968；[12]Xu W F，Qiao K，Huang S P，Peng H，Huang W S，Chen F Y，Zhang N，Wang，G Z，Wang K J.The expression pattern of scygonadin during the ontogenesis of Scylla paramamosain predicting its potential role in reproductive immunity[J].Dev Comp Immunol.，2011，In press)，arasin([13]K，Haug T，Sperstad SV，Rekdal O，Indrevoll B，Styrvold OB.Arasin 1，a proline-arginine-rich antimicrobial peptide isolated from the spider crab，Hyas araneus[J].DevComp Immunol.，2008，32(3)：275-285；[14]Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakajon A.Twonovel antimicrobial peptides，arasin-likeSp and GRPSp，from the mud crab Scylla paramamosain，exhibit the activity against some crustacean pathogenic bacteria.Fish Shellfish Immunol.，2011，30(2)：706-712)和GRPSp。其中scygonadin基因是甲壳动物中第1个被鉴定为主要在雄性生殖腺中特异性转录表达的阴离子抗菌肽([15]黄文树.锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定[D].厦门大学博士学位论文，2006)。