[发明专利]一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法

权利要求书

1.一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法，其步骤是：

A、将实验所用的所有试剂、耗材用0.1％v/v焦碳酸二乙酯水浸泡过夜后高压灭菌，不可高压灭菌的试剂，用0.1％v/v焦碳酸二乙酯处理过的水配制，所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、20％w/w十二烷基硫酸钠、6％w/w硅藻土、5M异硫氰酸胍、聚乙二醇6000溶液、72％～75％v/v乙醇和0.1％v/v焦碳酸二乙酯处理水；

B、采集森林土壤或森林凋落物样品，剪碎后投入液氮中速冻，经冷冻干燥仪冷冻干燥，磨细、混匀，得粉末样品，将粉末样品置于-70℃保存；

C、取于-70℃保存的粉末样品0.2～0.5g，加入300～400μL0.1％v/v焦碳酸二乙酯处理水，待水渗透样品后，得混合物A，将混合物A放入-70℃，过夜；

D、于经-70℃过夜的混合物A中，分别加入0.2～0.5g玻璃珠混合物、100～400μL十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、20～80μL 20％w/w十二烷基硫酸钠、40～80μL 6％w/w硅藻土和300～500μL酚/氯仿/异戊醇混合液，于涡旋仪上混匀，得混合液B；其中玻璃珠混合物中0.1mm和0.5mm直径玻璃珠的质量比为1∶1，十六烷基三甲基溴化铵缓冲液中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为5％w/w、磷酸缓冲液的浓度为120mM、氯化钠的浓度为0.35M、pH值为8.0～8.5，酚/氯仿/异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1、pH值为8.0；

E、将所得混合液B放入快速核酸提取仪，以4.5～5.5m/s的速度裂解细胞30～45s后，于4℃、14000rpm，离心10～15min，得上清液；

F、步骤E所得的上清液中加入100μL 5M异硫氰酸胍，混匀，于4℃、12000～14000rpm，离心5～10min，得上清液，并重复该步骤1～3次；

G、步骤E所得的上清液或步骤F所得的上清液中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，氯仿/异戊醇混合液中氯仿、异戊醇的体积比为24∶1，混匀，于4℃、12000～14000rpm，离心10min，得上清液；

H、步骤G所得的上清液中加入2倍体积的聚乙二醇6000溶液，聚乙二醇6000溶液中聚乙二醇6000的浓度为30％～40％w/w、氯化钠的浓度为1.5～2.0M，混匀，室温放置1～2h以沉淀核酸；于4℃、14000rpm，离心10min，弃掉上清液，得核酸沉淀；

I、用300～400μL预冷的72％～75％v/v乙醇，分两次清洗步骤H所得的核酸沉淀，瞬时离心10～15s，用移液器吸走残留乙醇溶液，于超净工作台中，自然晾干5～10min，加50～100μL 0.1％v/v焦碳酸二乙酯处理水，溶解，混匀，得DNA/RNA溶液C；

J、用琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性，用DNA酶消化DNA/RNA溶液C中的DNA，得RNA溶液D，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA溶液D中RNA的完整性，用核酸蛋白测定仪检测RNA溶液D中RNA的浓度和纯度，并将RNA溶液D保存于-70℃备用。