[发明专利]一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种提取微生物总RNA的方法，尤其涉及一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法。该方法主要适合于科研、教学、环保等部门对森林土壤和凋落物中微生物功能基因转录组学研究过程中，提取样品中的微生物总RNA。

背景技术

现有技术条件下，95％以上微生物不可培养，这是传统微生物生态学在揭示自然界微生物群落结构、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透，直接对环境样品中分离的微生物总DNA进行分析的方法，在一定程度上弥补了传统培养方法所存在的局限性。但是，由于基因表达的时空特异性，复杂环境条件下环境微生物基因特异性表达及其功能并不能通过对微生物DNA的研究得到揭示，而这种信息是生态环境研究中的重要部分。近年来，通过转录组学的方法，从mRNA水平上研究环境微生物，取得了很大的成功，且获得的结果更准确、可靠。该方法首先通过提取样品中所有微生物的RNA，将其中的mRNA反转录为cDNA，再运用定量PCR、Northern杂交和cDNA文库构建等下游实验技术研究功能基因的丰度、群落结构和生态功能等。因此，获得高质量的RNA是顺利进行该方法下游实验的最基本前提。

森林凋落物的微生物分解直接影响着森林土壤肥力和森林生态系统养分循环过程。对森林凋落物和土壤中微生物群落结构和功能的研究，已成为国际土壤微生物研究领域的热点。但森林凋落物和土壤中含丰富的腐殖酸、多糖、多酚等物质，使提取的微生物总RNA纯度不高，且环境中广泛存在着RNA酶，RNA易被其降解，给RNA提取带来了许多困难。有为数不多的商业公司研发了土壤RNA提取试剂盒，但价格昂贵，且对土壤样品选择性较强，尤其是提取森林凋落物中微生物总RNA时，所提的RNA产量低、效果不稳定。而绝大部分通过手提法获得的土壤微生物总RNA产量不高、腐殖酸污染较严重，会干扰下游试验的顺利进行。此外，目前对环境微生物总RNA提取的方法主要针对土壤、堆肥、水和大气等环境样品，尚缺乏针对森林凋落物中微生物总RNA的有效提取方法。因此，开发一种高产量、高质量的既适合森林土壤又适合森林凋落物中微生物总RNA提取的方法，是进行森林生态系统凋落物微生物分解过程研究的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法，利用该方法提取的微生物总RNA产量高、完整性好、纯度较好。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法，其步骤是：

A、将实验所用的所有试剂、耗材用0.1％(v/v，以下相同)焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡过夜后高压灭菌，若配制的试剂不可高压灭菌，用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水配制，所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液、20％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)、6％(w/w)硅藻土、5M异硫氰酸胍(GITC)、聚乙二醇6000(PEG6000)溶液、72％～75％(v/v)乙醇和0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水等，所述的耗材包括碾钵、碾棒、玻璃珠、离心管、吸头和试剂瓶等。

B、采集新鲜森林土壤或森林凋落物样品，剪碎后立即投入液氮中速冻，经冷冻干燥仪冷冻干燥，磨细、混匀，得粉末样品，将粉末样品置于-70℃保存。

C、取于-70℃保存的粉末样品0.2～0.5g，加入300～400μL0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，待水渗透样品后，得混合物A，将混合物A放入-70℃，过夜；

D、于经-70℃过夜的混合物A中，分别加入0.2～0.5g玻璃珠混合物、100～400μL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液、20～80μL20％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)、40～80μL 6％(w/w)硅藻土和300～500μL酚/氯仿/异戊醇混合液，于涡旋仪上混匀，得混合液B；其中玻璃珠混合物中0.1mm和0.5mm直径玻璃珠的质量比为1∶1，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的浓度为5％(w/w)、磷酸缓冲液的浓度为120mM、氯化钠(NaCl)的浓度为0.35M、pH值为8.0～8.5，酚/氯仿/异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1、pH值为8.0；

E、将所得混合液B放入快速核酸提取仪，以4.5～5.5m/s的速度裂解细胞30～45s后，于4℃、14000rpm，离心10～15min，得上清液；