[发明专利]DREB基因转化红掌的遗传转化方法

权利要求书

1.DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：

1)无菌愈伤组织的获得：

取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基；

2)农杆菌悬浮液制备中：

将插入目的基因DREB的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；

3)遗传转化

选取步骤1)中在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100μmg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；

4)抗性愈伤组织筛选

切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2.0-3.0cm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0.1mg/L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0.1mg/L培养基中正常生根；

5)转基因植株的获得

待步骤4)得到的具有潮霉素抗性的植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，，设计并合成SEQ ID No.3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No.4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR鉴定结果能够扩增出950bp条带的抗性植物为转入目的基因DREBa成功的转基因红掌植株。

2.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于所述的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa通过如下方法构建：

①DREBa基因克隆

以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板，以SEQ ID No.1所示的正向引物DREBa-F和SEQ IDNo.2所示的反向引物DREBa-R进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF，用琼脂糖凝胶电泳回收纯化长度为872bp的RT-PCR目的产物片段，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃，16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证，DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF序列如SEQ ID No.5所示；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建

用BamH I和Kpn I双酶切连接了DREBa基因的T-载体，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃，16h，提取质粒，经BamH I和KpnI双酶切鉴定得到pCAMBIA1301-DREBa重组质粒。