[发明专利]DREB基因转化红掌的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及DREB基因转化红掌的遗传转化方法。

背景技术

红掌为天南星科花烛属多年生草本植物，原产哥伦比亚南部，是世界名贵花卉。红掌具有艳丽的佛艳苞，花期长、周年开花、叶片蜡质，是观叶观花俱佳的室内观赏植物。红掌夜间生长适温在18-20℃，白天为25℃左右。在夏季，如夜间室温度超过25℃或白天室内温度超过30℃时，而在冬季，如夜间室温度低于12℃或白天室温度低于18℃时，则会出现叶片失去光泽、发黄，佛艳苞花期变短，易枯萎，还会引起叶腐病，严重影响其生长和观赏价值。为此，在夏季期必须采取人为降温措施，而在冬季则必须人为进行加温，使得室内温度适宜红掌的生长，然而降温和加温都显著地增加了红掌生产成本。因此，筛选、培育耐高温和低温的红掌新品种有着巨大的实用价值和经济意义。

近年来，随着植物基因工程的发展，分子育种克服了常规育种的种种限制，为利用新的基因资源改良红掌品种提供了新的手段和途径。农杆菌介导法以其操作简单，费用低，效率高，插入DNA片段大，稳定性好，转基因拷贝数低等优点，已成为转基因策略中的首选方法。

DREB转录因子作为一类在植物抵抗非生物胁迫中起关键作用的转录因子家族，以其能够激活多个功能基因的表达，从而提高植物综合抗性的优点成为研究的热点，在植物抗逆分子育种中具有巨大的潜在利用价值。近年来，通过导入DREB基因来改良作物的抗逆性，已经在油菜、烟草、番茄、小麦和菊花等作物中获得成功，但利用DREB基因转化红掌的研究还未见报道。主要原因是红掌的遗传转化极易受到各种因素影响，例如愈伤组织的预培养时间、农杆菌的侵染时间、愈伤组织与农杆菌的共培养时间及抑菌培养时间等等，这些因素直接影响着红掌的转化成功率。因此，系统深入研究其遗传转化条件，建立专门针对红掌的遗传转化体系，可为红掌分子育种工作提供理论基础和实验依据，有效推进红掌分子育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供DREB基因转化红掌的遗传转化方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

DRB基因转化红掌的遗传转化方法，包括如下步骤：

1)无菌愈伤组织的获得：

取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.1mg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基；

2)农杆菌悬浮液制备中：

将插入目的基因DREB的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；

3)遗传转化

选取步骤1)中在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染10min，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26±2℃、黑暗条件下共培养3天；之后转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+AS 100μmg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26±2℃，光照时间为16h/d；再转入MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26±2℃，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；

4)抗性愈伤组织筛选

切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L上，在温度为26±2℃，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2.0-3.0cm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0.1mg/L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0.1mg/L培养基中正常生根；

5)转基因植株的获得